إعداد بيئة زراعة الانسجة النباتية

يمكن شراء البيئات المختلفة المستخدمة في زراعة الأنسجة جاهزة في صورة مسحوق يحتوي على كل العناصر والإضافات المختلفة عدا السكر. وتوجد هذه المستحضرات في عبوات تكفى الواحدة لتحضير 1، 5 ، 10، 50، 100 لتر. كما يمكن شراء بعض المكونات مثل العناصر الصغرى أو الكبرى أو فيتامينات إحدى البيئات مثل العناصر الصغرى لـ B5 وفى معظم الحالات يكون هذا النوع من البينات غير اقتصادي في الإنتاج التجاري لارتفاع ثمنه وعند تحضير البيئة معمليا يجب ملاحظة ما يأتي:

1. استعمال كيماويات عالية النقاوة ويفضل شراء الكيماويات في عبوات قليلة الوزن ما أمكن حتى لا تفسد بالتميز أو التلوث بكيماويات أخرى.

2. البيئة الجاهزة لا تتكون من نفس الأملاح المكونة للبيئة عند تجهيزها معملياً. بمعنى أنه يمكن أن تحتوي البيئة على نفس تركيز أيونات الكالسيوم مثلا لكن باستخدام أملاح مختلفة.

3. يراعى أن يتم استخدام زجاجيات نظيفة جدا وتعقيم الأوعية المستخدمة للزراعة تعقيما رطباً إذا كانت تحتوي على بيئة سابقه قبل استعمالها للزراعة.

4. تغطية الأوعية والزجاجات بمجرد غسلها وبعد تجفيفها حتى لا تتلوث بالغبار ويستحسن عدم تخزين الأدوات لمدة طويلة بعد غسلها.

5. يمكن أن تخزن البيئة بعد تحضيرها لعدة أسابيع على درجة حرارة 4 - 10 م أما التخزين في درجة حرارة عالية فإنه يؤدى إلى تبخير الماء وبالتالي يختل تركيز المركبات المختلفة.

ويتم تجهيز البيئة بإذابة الأملاح في الماء ثم ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول وإضافة الأجار وبعد ذلك تصب في الأوعية الخاصة بالزراعة ثم تعقم. وفي بعض الأحيان يفضل تعقيم البيئة في كميات كبيرة قبل توزيعها لتلافي حدوث تغير في الاجار والسكر عند تعقيم كميات قليلة خصوصا إذا كان الرقم الهيدروجيني منخفض. وإذا كانت البيئة تحتوى على أحد المواد ذات الثبات الحرارى المنخفض كبعض الهرمونات والمضادات الحيوية والإنزيمات فإنها تعقم باستعمال مرشحات ذات اقطار 0.45 ميكرون ثم تضاف للبيئة المعقمة قبل صبها مباشرة (درجة الحرارة 40°م). ولضمان الإعداد الجيد للبيئة يوصى بأخذ الاحتياطات الآتية:

1. يراعى الدقة في قياس المحاليل ووزن الكيماويات وعدم تلوث بعضها ببعض ويفضل تخصيص ملعقة لكل نوع من الكيماويات المستعملة لتلافي التلوث.

2. إذا حفظت بعض محاليل الأساس كالفيتامينات في المجمد فيجب حفظها في كميات صغيرة تكفى 1 - 10 لتر حتى لا نضطر إلى إذابة المحلول ثم تجميده عند كل تحضير.

3. بعد تجهيز البيئة يتم ضبط الرقم الهيدروجيني قبل التعقيم مباشرة.

4. إذا كانت البيئة المستعملة سائلة يستحسن أن يخفض الرقم الهيدروجيني حتى تقلل من ترسيب الأيونات. كما أن انخفاض الرقم الهيدروجيني يقلل من تلوث المزرعة وحيث أن الرقم الهيدروجيني ينخفض أثناء التعقيم فإنه يفضل ضبط الرقم الهيدروجيني على 6 حتى يصل إلى 5.7-5.9 بعد التعقيم لكن يلاحظ أن ارتفاع الرقم الهيدروجيني عن 7-8 يؤدى إلى ترسيب أيونات الكالسيوم. وهناك طريقة أخرى لضبط الرقم الهيدروجيني بعد التعقيم وإن كانت صعبة من الناحية العملية. فبعد تحضير البيئة يتم ضبط الرقم الهيدروجيني على 6 ثم يؤخذ جزء صغير وليكن 100 مل مثلا ويعقم منفردا. وبعد التعقيم يعاد ضبط الرقم الهيدروجيني لهذا الجزء ويتم حساب كمية NaOH أو HCI اللازمة لتعديل الرقم الهيدروجيني للبيئة ويتم أضافه هذه الكمية بعد تعقيمها بالترشيح إلى البيئة تحت ظروف تعقيم.

5. بعد تجهيز البيئة يجب عدم تخزينها مدة طويلة قبل التعقيم حتى لا تنمو عليها الكائنات الدقيقة وبالتالي تغير من المحتوى الكيماوي لها، وقد تفرز بها بعض السموم.

6. يجب حفظ البيئة بمجرد إعدادها وتعقيمها في مكان مظلم على درجة حرارة 5 م لمنع البخر.

7. قد يحدث تلوث للبيئة بعد التعقيم أو لمحاليل الأساس وفى هذه الحالة يجب عدم استعمالها وتعقيمها قبل التخلص منها. ويعرف التلوث الحادث في المحلول بعدة صفات حسب نوع التلوث فالخمائر تعطى المحلول لون يشبه اللبن أما الفطريات فتتميز بوجود الهيفات وإن كانت البيئة سائلة وموجودة على هزاز تلاحظ تكوين كرات من الفطر أما التلوث البكتيري فيلاحظ بوجود عكارة ورائحة تميز بعض الأجناس المختلفة من البكتريا.

وقد اقترح Gamber أهمية إضافة الأملاح للماء كما هو وارد في ترتيب مكونات البيئة وذلك لتفادى ترسيب بعض الأملاح فمثلا يضاف النتروجين المعدني أولا حتى لا تترسب أملاح الفوسفات والكالسيوم. لكن لما كان تركيز الأملاح المستعمل لتجهيز البيئة منخفض جداً ومن الصعب الحصول على هذه الأوزان بدقة فإنه يفضل عمل محاليل مركزة والتي تعرف بمحاليل الأساس لواحد أو عدد من الأملاح ثم تخفف للحصول على التركيز النهائي ويوفر ذلك كثيرا من الوقت. وفى الغالب يكون تركيز محاليل الأساس 10 - 20 مرة أعلى من التركيز النهائي، ويتم إعداد المحاليل الأساسية الآتية:

1. العناصر الكبرى بتركيز 10 أضعاف التركيز النهائي ويمكن حفظ هذا المحلول بالثلاجة لمدة طويلة كما يمكن حفظها مجمدا أيضا. لكن يفضل إذابة تلك الأملاح مباشرة عند التحضير.

2. العناصر الصغرى عدا الحديد يتم إعداد محلول منها تركيزه 10 أو 100 مرة ضعف التركيز النهائي ويحفظ بالثلاجة.

3. الحديد يتم إعداد محلول بإذابة 2.78 جم من كبريتات الحديدوزFeSO4.7H₂O  و 3.73 جم منNa2EDTA.7M2O  في 1000 مل ماء ليعطى محلول تركيزه 100 مرة أعلى من تركيز الحديد في MS ويحفظ في الثلاجة.

4. الفيتامينات والأحماض الأمينية يتم إعداد محلول الأساس منها بتركيز 100 - 1000 مرة أعلى من التركيز في المحلول النهائي وتحفظ في المجمد على درجة -4 م.

5. يتم إعداد محلول الأساس من منظمات النمو المختلفة بحيث يكون تركيزه 100 مرة ضعف تركيزه في المحلول النهائي ويحفظ بالثلاجة. ويوضح جدول رقم (1) طريقة تحضير محلول قياسي قوته مليمول واحد من منظمات النمو المختلفة، ويمكن الاستعانة بجدول رقم (2) لتحويل الوزن بالجرام إلى مول.

6. عند تحضير حجم معين من البيئة يتم إضافة القدر اللازم من هذه المحاليل إلى كمية من الماء تقل قليلا عن الحجم النهائي ثم يضاف السكر ويكمل الحجم ويضبط الرقم الهيدروجيني.

وفيما يلي إحدى الطرق الموصى بها لتحضير 1 لتر من بيئة MS

1. تذاب الكميات آلاتية في 100 مل ماء مقطر لتحضير محلول أساس (أ) تركيزه 100 مره التركيز النهائي

2. تذاب الكميات الآتية في 100 مل ماء مقطر لتحضير محلول أساس (ب) تركيزه 100 مرة التركيز النهائي

FeSO4. 7H20                      287 ملجم

 Na2EDTA.2H2O                 237 ملجم

3. تذاب الكميات الآتية في 100 مل ماء مقطر لتحضير محلول أساس (ج) تركيزه 100 مرة قدر التركيز النهائي

Glycine                      200 ملجم

Nicotinic acid             50 ملجم

Pyridoxine-HCI           50 ملجم

Thiamine-HCl             10 ملجم

4. تذاب الكميات الآتية في 500 مل ماء مقطر

NH4NO3                   1650 ملجم

KNO3                        1900 ملجم

MgSO4.7H2O             730 ملجم

KH2PO4                    170 ملجم

CaC2.2H2O                44 ملجم

5. أضف للمحلول السابق 100 مليجرام ميوانوزيتول.

6. أضف 10 مل من المحلول (أ) و 10 مل من المحلول (ب) و 10 مل من المحلول (ج).

7. أضف 30 جم من السكر.

8. اكمل الحجم إلى 900 مل واضبط الرقم الهيدروجيني ثم اكمل الحجم إلى الحجم النهائي باستعمال كأس مدرج أو دورق معياري.

9. أضف المادة المصلبة اللازمة إلى دورق ثم صب الكمية المحددة من البيئة. يلاحظ أن الوعاء المحتوى على البيئة لا يكون ممتلئ حتى لا يحدث فوران أثناء التعقيم.

10. عقم البيئة بجهاز التعقيم الرطب على درجة 121 °م لمدة 15 - 20 دقيقة.

11. اترك البيئة لتبرد في حمام مائي إلى درجة 40 - 50 م ثم صبها في أواني الزراعة بالكمية المناسبة.

12. المواد ذات الثابت الحراري المنخفض تعقم بالترشيح وتضاف قبل صب البيئة في أواني الزراعة.

جدول 1: طريقة تحضير المحلول القياسي 1 مليمول من بعض منظمات النمو.

جدول 2: تحويل تركيز منظمات النمو من ملجم / لتر الى ميكرومول.