عزل وزراعة البروتوبلاست

تتميز الخلية النباتية بوجود جدار سميك صلب يحيط بالخلية من الخارج يعرف بالجدار الخلوي. ويعتبر هذا الجدار العامل الأساسي في تحديد شكل الخلية وتكوين الدعامة الأساسية للنبات، بالإضافة لكونه خط الحماية الأول ضد العوامل الخارجية، ودوره في تكوين الأنسجة والاتصال بين الخلايا وبعضها البعض. وبالرغم من هذا الدور فإنه يعتبر من وجهة نظر علماء الأحياء عائقاً لإحداث دمج الخلايا للحصول على هجن جسدية. ومن ثم اتجهوا إلى محاولة إزالة هذا الجدار لإتمام عملية الدمج البروتوبلاستي. وكانت بداية هذا النجاح عندما استطاع (1960) Cocking في استخلاص إنزيم Cellulase من فطر Myrothecum verrucaria. حيث أمكن باستخدام هذا الإنزيم هدم السيلولوز المكون للجدار الخلوي وتحرير البروتوبلاست أي الخلية منزوعة الجدار الخلوي في صورة حية من القمم النامية لجذور الطماطم وبعد نجاح المحاولات الأولى في عزل البروتوبلاست تم إحداث تطور للتقنية المستعملة لعزل البروتوبلاست وزراعته في وسط مغذى للحصول على نباتات كاملة وكان لذلك دورا هاما في التحسين النباتي للعديد من الأنواع النباتية. وتجدر الإشارة إلى أن (1971) .Takebe et al حصول على أول نبات دخان كامل من زراعة البروتوبلاست ومن أهم التطبيقات العملية لتقنية عزل وزراعة البروتوبلاست استخدامها في برامج تربية النباتات ذات العقم الذكرى السيتوبلازمي. ومن المراجع الجيدة التي تعالج هذا الموضوع (1987) Pierik و George (2008), Veilleux et al. (2005), (Bhojwani and Razdan (1996).

طبيعة البروتوبلاست

يعتبر البروتوبلاست خلية عارية منزوعة الجدار الخلوي كما في الشكل التالي أي أنه عبارة عن سيتوبلازم محاط بغشاء خلوي فقط ذو شحنات سالبة ويسبب ذلك تنافر بين البروتوبلاست وبعضه البعض، وكذلك بينه وبين الجزئيات الأخرى التي تحمل نفس الشحنة والموجودة في الوسط المحيط ولو تم تحرير البروتوبلاست في ماء أو وسط غذائي ذو ضغط اسموزي عادى فإن البروتوبلاست سوف ينفجر بسرعة لامتصاصه الماء ولعدم وجود الضغط الجداري الذي يضاد الضغط الاسموزي للسيتوبلازم. ومن ثم يتبين ضرورة استعمال محلول ذو ضغط اسموزي مرتفع ومناسب أي ذو قيمة سالبة عالية أثناء فصل البروتوبلاست. وإذا كان الضغط الاسموزي لمحلول الفصل منخفض جدا يلاحظ بلزمة البروتوبلاست بخروج الماء إلى الوسط الخارجي ويسبب ذلك ضرر شديد للبروتوبلاست وبمجرد إزالة الجدار الخلوي يتحرر البروتوبلاست في وسط الفصل المناسب من الناحية الاسموزية بشكل كروي. وتشاهد بروزات كروية على السطح الخارجي للغشاء البروتوبلاستي بسبب وجود فجوات في الغشاء، وتعتبر هذه البروزات مناطق ضعف في الطبقة الثنائية اللبيدات المكونة للغشاء الخارجي. ويجب عدم اعتبار هذه الزوائد التي قد توجد على السطح الخارجي للبروتوبلاست دليل على بداية حدوث انقسام.

شكل يبين : البروتوبلاست المعزول من خلايا الأوراق.

بالطبع الغشاء البلازمي غير قوي التركيب مقارنة بالجدار الخلوي ولذا يعتبر البروتوبلاست شديد الحساسية للظروف الخارجية والحركة الميكانيكية. وتسبب هذه العوامل ضرر شديد أو انفجار أو على الأقل فقد الحيوية والقدرة على التكشف. وعلى هذا يجب توخى الحذر الشديد أثناء فصل وزراعة البروتوبلاست. وبصورة عامة فإن البروتوبلاست الكبير الحجم مثل ذلك المعزول من خلايا الميزوفيل أشد حساسية للظروف المحيطة عن البروتوبلاست الصغير الحجم المعزول من المعلق الخلوي، وينبغي أن يشار إلى وجود عوامل أخرى غير الحجم تؤثر في حساسية وحيوية البروتوبلاست.

عزل البروتوبلاست

استهلت هذه الطريقة مبكراً على يد Klercker في عام 1892 حيث عزل البروتوبلاست بعد تقطيع الأنسجة إلى أجزاء صغيرة ووضعها في محلول مناسب يعمل على بلزمة الخلايا فتحرر البروتوبلاست من تلك التي قطع جدارها الخلوي بدون اصابة الغشاء السيتوبلازمي. لكن حتى الآن تعتبر الطرق الميكانيكية غير جيدة لأنها تنتج محصول قليل من البروتوبلاست. أما تعتبر عملية فصل البروتوبلاست من العمليات البسيطة من الناحية النظرية بواسطة بعض الأنزيمات المحللة للسكريات العديدة المكونة للجدار الخلوي. ويستقبل البروتوبلاست المحرر في وسط ذو ضغط اسموزي مرتفع لمنع انفجاره. لكن من الناحية العملية هناك العديد من العوامل التي تؤثر في محصول البروتوبلاست وحيويته وتكشفه بعد ذلك، ومن هذه العوامل ما يتعلق بالنسيج النباتي أو المعلق الخلوي المستعمل كمصدر للبروتوبلاست والإنزيمات المستخدمة لهدم الجدار الخلوي وبعض الظروف البيئة الأخرى.

لذا فإنه لابد من إجراء عدة تجارب لمعرفة هذه العوامل للوصول إلى التوليفة المثلى لنجاح عزل وزراعة البروتوبلاست. فقد تكون الظروف المناسبة لعزل بروتوبلاست صنف ما غير مناسبة لصنف آخر من نفس النوع النباتي. وفي معظم التجارب يكون المصدر الشائع لفصل البروتوبلاست هو الأوراق، إذ تحتوي أنسجة الورقة غالبا على بروتوبلاست ذو قدرة عالية على الانقسام بعد العزل والزراعة. ويفضل أن يتم الحصول على الأوراق من نباتات نامية في القوارير أو البيت المحمي للتحكم في درجات الحراة والضوء والعناصر المغذية . وينجح استخدام أنسجة الأوراق صغيرة العمر حديثة الانبساط مع العديد من النباتات ذات الفلقتين، لكن قد تكون هناك صعوبة في حالة ذوات الفلقة الواحدة وعندها يمكن استخدام مزارع المعلق الخلوي. وفي بعض الحالات كان البروتوبلاست المعزول من أجزاء نباتية أخرى ذو قدرة أعلى على الانقسام وأكثر ملائمة لأغراض معينة كاستعمال بروتوبلاست حبوب اللقاح للحصول على نباتات أحادية وتحتاج الأنسجة المختلفة إلى تركيزات أعلى من إنزيمات الهضم أو مده أطول مقارنة باستعمال أنسجة الورقة. وقد تكون هذه المعاملات ذات تأثير سلبي على محصول البروتوبلاست وحيويته.

قد تشارك معظم الخلايا الموجودة في النسيج المستعمل في محصول البروتوبلاست المعزول ولذا يفضل استعمال نسيج يحتوي على نوع واحد من الخلايا كحبوب لقاح للحد من عدم تجانس البروتوبلاست الناتج أو توفير الظروف المثلى لعزل بروتوبلاست نوع معين من الخلايا فعل سبيل المثال يمكن فصل بروتوبلاست الخلايا الحارسة باستعمال تركيز مخفف جداً من الإنزيمات بالمقارنة مع باقي أنسجة الورقة. هذا وقد يحدث انتخاب تلقائي لبعض البروتوبلاست بسبب الاختلاف في القدرة على تحرر بروتوبلاست بعض الخلايا دون غيرها مثلاً من الصعب تحرر بروتوبلاست خلايا بشرة الأوراق. ويمكن بعد الفصل انتخاب بروتوبلاست نوع محدد من الخلايا إذا أمكن تميزه بصفة معينة كوجود صبغة معينه وتقسم مراحل فصل البروتوبلاست إلى الخطوات التالية:

1. إعداد إنزيمات هضم الجدار الخلوي

يتكون الجدار الخلوي غالباً من ثلاث مواد عديدة التسكر هيcellulose, ꞵ1-4 glucan, hemiclllulose  وكذلك البكتين الذي يعتبر من الكربوهيدرات الأكثر تعقيداً. وعلى هذا لابد أن يحتوي المحلول الإنزيمي المستعمل لهدم الجدار الخلوي على إنزيمات cellulose, hemicellulase و pectinase. ويتم الحصول عليها من بعض الفطريات مثل Aspergillus nigra, Trichodermia viride أو بعض المصادر الأخرى كبعض القواقع. ويختلف الفعل الإنزيمي قليلا لكنه قد يكون مؤثراً باختلاف مصدره ومن ثم قد يضطر إلى تجريب إنزيمات من مصادر مختلفة للتغلب على الاختلافات الموجودة في تركيب الجدر الخلوية في الأنواع المختلفة أو في نفس الخلايا النامية تحت ظروف متباينة. ومن النادر استعمال إنزيمات عالية النقاوة نظرا لارتفاع ثمنها ولأن الشوائب كالإنزيمات الأخرى لها أثر إيجابي في هدم الجدار الخلوي وحتى بعض المستحضرات النقية مثل 10-cellulase R تحتوي على كميات من إنزيمات أخرى.

وتحتوي المستحضرات التجارية لإنزيمات الفصل مثل Driselase على خليط من إنزيمات cellulase, hemicellulase و laminarinase و pectinases xylanase وهو ذو فاعلية في عملية العزل. لكن يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن بعض الشوائب مثل proteases و lipases و ribonuclases وبعض المواد الفينولية والأملاح لها تأثير سلبي على كمية البروتوبلاست المعزولة وكذلك حيوية البروتوبلاست وقدرته على التكشف. ولهذا قد تتم عملية تنقية جزئية لمحلول الإنزيمات المستعمل بالترشيح في حالة مواجهة بعض الصعوبات في عملية الفصل والزراعة. ومن المهم أن يقلل زمن تعرض الخلايا لمحلول الهضم لتقليل الضرر الحادث من الإنزيمات والشوائب إلى أقل حد ممكن. ويتراوح زمن الهضم في الغالب من 4 - 12 ساعة وباستعمال 10 مل من مخلوط الهضم لكل جرام واحد من الأنسجة. ويتم ذلك على درجة الحرارة 25-30 م على الرغم أنها ليست المثلى لعمل إنزيمات الهضم والتي تتراوح بين 40-50 م ورقم هيدروجيني 4.7 - 6.0.

قد لا تتمكن الإنزيمات المضافة للنسيج المستعمل لعزل البروتوبلاست من الوصول إلى الجدار الخلوي مباشرة حيث تمثل طبقة الكيوتيكل والبشرة الخارجية عائقاً لوصول الإنزيمات والتي تعتبر جزئيات ذات حجم كبير نسبيا إلى الجدر الخلوية. ولتسهيل عمل الإنزيمات يقطع النسيج المستعمل بعد نزع طبقة البشرة باليد إن أمكن إلى شرائح صغيرة بعرض 1 - 2 مم، أو يتم عمل بعض الجروح السطيحة في النسيج باستعمال فرشاة ناعمة وعادة يمكن الحصول على مليون إلى 50 مليون بروتوبلاست من جرام واحد من أنسجة الأوراق حديثة النمو. أما الكالس فيجب تقسيمة إلى أجزاء صغيرة قبل المعاملة بالإنزيم. وقد يتم إضافة المحلول المستعمل بالهضم تحت تفريغ لتمكين الإنزيمات من النفاذ إلى الجدر الخلوية، وقد تمكن (1978 .Scott et al) باستخدام التفريغ تقليل الوقت الضروري لعمل الإنزيمات من ساعتين إلى عدة دقائق. ويرى البعض وضع المخلوط مع الأنسجة على أجهزة رج ذات سرعة منخفضة جدا لتسهيل عمل الأنزيمات وعزل البروتوبلاست.

2. ضبط الضغط الاسموزي لوسط الفصل

كما سبق القول يعتبر الضغط الاسموزي للمحلول المستعمل في فصل البروتوبلاست العامل المحدد لنجاح هذه الخطوة. ويتباين الضغط الاسموزي للبروتوبلاست طبقاً لظروف نمو النبات الأم ونوع النسيج والبروتوبلاست أكثر ثباتا في المحلول ذو الأسموزية العالية عن المنخفض، فإذا استعمل محلول له ضغط أسموزي ذو قيمة سالبة عالية جداً حدثت بلزمة شديدة في البروتوبلاست فيمنع انفجاره وبرعمته. لكن تعتبر البلزمة نوع من الإجهاد الخلوي فيلاحظ انخفاض في حيوية البروتوبلاست ويزيد نشاط إنزيم nuclease وتقل عدد الريبوسومات وينخفض معدل امتصاص الأحماض الأمينية. وربما يرجع ذلك إلى انخفاض معدل تخليق البروتين وبعض عمليات التمثيل الأخرى. أضف إلى ذلك زيادة امتصاص بعض المواد السامة للبروتوبلاست بسبب البلزمة حيث تزيد نفاذية الغشاء لهذه الجزئيات. ولهذا السبب قد تتم عملية البلزمة كخطوة منفصلة قبل عزل البروتوبلاست إذا كانت الخلايا شديدة الحساسية للبلزمة للحد من امتصاص الجزيئات الضارة. ويتم ذلك باستعمال محلول ذو ضغط اسموزي مرتفع أولا حتى لا يسبب انفجار البروتوبلاست ثم تضاف إنزيمات هدم الجدار.

ويتم ضبط الضغط الاسموزي لوسط العزل باستعمال بعض المواد ذات الضغط الاسموزي العالي والتي قد تكون أملاح متأينة مثل كلوريد الكالسيوم بتركيز 50-100 مليمول أو البوتاسيوم أو سلفات الماغنسيوم (40 مليمول). وتلك المركبات لا تدخل في عمليات التمثيل بالمرة أو تتم لها عملية التمثيل ببطء وبذلك يحافظ على الضغط الاسموزي للوسط. ويفضل استعمال مواد غير متأينة للغرض ذاته وهي عبارة عن السكريات الكحولية مثل السوربيتول والمانيتول (بتركيز 450-700 مليمول) والتي لا تدخل في عمليات التمثيل لذا يظل الضغط الاسموزي للوسط ثابتاً. أما سكريات الفركتوز والجلوكوز والسكروز فنادراً ما تستعمل حيث يحدث لهما هدم في الخلايا وبذلك يتغير الضغط الاسموزي للوسط مسبباً بعض المشاكل. وبالرغم من ذلك قد يستعمل السكروز بتركيز 0.3 - 0.7 مولر أو الجلوكوز إذا كان من المرغوب حدوث ارتفاع تدريجي في الضغط الاسموزي ولنفس السبب يمكن استعمال خليط من المواد النشطة أيضاً مع مادة غير نشطة.

3. المعاملة الأولية للجزء النباتي المستعمل

إن ظروف نمو النسيج النباتي المستعمل لعزل البروتوبلاست في غاية الأهمية لنجاح عزل وزراعة البروتوبلاست ومن هذه العوامل الحرارة والضوء، والرطوبة، وعمر النسيج. وتعتبر الظروف المثلى لنجاح ذلك محل تجريب لتباين تركيب الجدار الخلوي تحت ظروف النمو المختلفة. وعموماً تعمل الظروف المثلى لنمو وانقسام الخلايا على زيادة محصول البروتوبلاست المعزول نظراً لقلة سمك الجدار الخلوي وربما تساعد على التكشف لاحقاً. ويمكن تحقيق ذلك بتنمية النباتات في الظلام لمدة 24-72 ساعة وعلى درجة حرارة 4-10 م قبل استعمالها كمصدر للبروتوبلاست، أو زيادة معدل التسميد الأزوتى للنباتات. أما إذا كان مصدر البروتوبلاست هو المعلق الخلوي فينصح بتجديد المعلق المستعمل كل أسبوع مع زيادة نسبة الأوكسين المستعمل وتقليل الكربوهيدرات في بيئة النمو قبل استعمال المعلق لعزل البروتوبلاست. ويؤثر عمر النبات المستعمل في عملية نجاح عزل البروتوبلاست فمثلا يتم عزل بروتوبلاست الدخان وعمر النبات 40-60 يوم بعد الإنبات وذلك للحصول على بروتوبلاست ذو حيوية عالية ولأسباب غير معروفة وجد أن كمية البروتوبلاست المعزولة من أنسجة النباتات المزهرة منخفضة. وينصح باستعمال مزارع الأشطاء لسهولة التحكم في ظروف النمو. وفي حالة استخدام المعلق الخلوي يجب تجديد المزرعة كل 3-7 أيام وتؤخذ الخلايا وهي في الطور اللاجي.

4. تنقية البروتوبلاست

بعد معاملة الأنسجة بالإنزيمات يتم تحريك الأنسجة بلطف حتى يتحرر البروتوبلاست من الأنسجة. ويجب الإسراع في إزالة مخلوط الإنزيمات وبقايا الأنسجة المتحللة وكذلك البروتوبلاست غير الحي والخلايا الميتة بمجرد عزل البروتوبلاست من الجدار الخلوي خاصة إذا كان مصدر البروتوبلاست انسجة نباتية. حيث يتحرر منها بعض الإنزيمات والمواد الفينولية التي قد ترتبط ببعض الإنزيمات غير النشطة وتنشطها مما يقلل من حيوية البروتوبلاست ويتم ذلك غالباً بفصل ناتج عملية الهضم باستخدام مصفاة لحجز بقايا الخلايا كبيرة الحجم ثم استخدام قطعة من قماش النيلون ذات أقطار 50-100 ميكروميتر لتسمح بمرور البروتوبلاست وتضمن هذه الطريقة الحصول على بروتوبلاست ذو أقطار واحدة وللحد من التأثير الضار للخلايا الميتة والمصابة اضاف (1992) Ochatt & Power محلول 0.5 % من potassium dextranet sulphate لمحلول الهضم. وبعد هذا الفصل المبدئي يمكن استعمال الطرد المركزي عدة مرات وإعادة انتشار البروتوبلاست في وسط جديد ذو ضغط أسموزي مناسب (20 % سكروز على سبيل المثال). ويجب توخى الحذر الشديد واستعمال سرعة منخفضة لجهاز الطرد المركزي (g 100) لمدة 7-10 دقائق حتى لا يحدث ضرر للبروتوبلاست السليم. يتم بعدها سحب البروتوبلاست السليم الطافي في المنطقة الفاصلة بين المحلول السكرى ومحلول استخلاص البروتوبلاست بحذر شديد باستعمال ماصة ذات فتحة واسعة ويعاد انتشار البروتوبلاست في وسط جديد لإعادة التنقية مرة أخرى. وهناك طرق أخرى لإجراء عملية التنقية تعتمد على نفس الأساس السابق. ويمكن الاستدلال على حيوية البروتوبلاست بعد الفصل باستعمال بعض الصبغات التي تميز الأغشية الحية مثل Calcofluor White (CFW), Pheosafranine  ,Flurescein diacetate (FAD) لكن الدليل القاطع على حيوية البروتوبلاست وجدوى الطريقة المستعملة للفصل هو تكوين الجدار الخلوي وحدوث الانقسام الخلوي.

يعتبر البروتوبلاست خلية نباتية تحت ظروف إجهاد من المحلول الاسموزي والمواد الأخرى الموجودة بمحلول العزل وكذلك المواد الناتجة من أيض البروتوبلاست نفسه. وتسبب عديد من هذه المؤثرات بلزمة للبروتوبلاست، ويكون معظم الإجهاد راجعاً لتأثير البلزمة والضغط الاسموزي وليس لإزالة الجدار الخلوي في حد ذاته. وبمجرد إزالة مخلوط الإنزيمات فإن البروتوبلاست يتجه إلى الأقلمة مع الظروف الجديدة. وقدرة البروتوبلاست المعزول من المعلق الخلوي على الأقلمة أعلى من ذلك المعزول من أنسجة نباتية، حيث أن ظروف نمو المعلق الخلوي تشبه إلى حد كبير ظروف عزل وزراعة البروتوبلاست إن لم تكن واحدة. لكن حتى في الظروف المثلى من الضغط الاسموزي وخلافة فإن بعض البروتوبلاست ينفجر لأسباب غير معروفة ويستمر ذلك غالباً لمدة يوم.

وبمجرد الأقلمة يلاحظ سرعة معدل تخليق البروتينات خاصة تلك المسئولة عن مقاومة الإجهاد ويعاد تخليق الجدار الخلوي. ويعتبر بدء تغيير الشكل الخارجي للبروتوبلاست من الكروي إلى المستطيل هو مؤشر تخليق الجدار الخلوي، كما يلاحظ زيادة في معدل تخليق عضيات الخلية والتنفس والأحماض النووية في هذه المرحلة. ومن غير المعروف حتى الآن لماذا لا يستمر انقسام البروتوبلاست في غياب الجدار الخلوي إلا أن هذه حقيقة مؤكدة. ويبدأ التكوين التلقائي لمكونات الجدار الخلوي عقب الطور اللاجي Lag من مراحل نمو الخلية وقد يحدث ذلك أيضاً أثناء عمليات الأقلمة. وتختلف مدة الطور اللاجي للبروتوبلاست باختلاف الأنواع النباتية وغالباً تتراوح بين ثلاث ساعات ويومين في Brassica، وتصل في البقوليات إلى أربعة أيام وتطول هذه المدة إلى أسبوع في بعض الأشجار. ويمتاز الجدار الخلوي المتكون حديثا بقصر السلاسل السيليولوزية المكونة له مع غياب الهيمسليولوز والذى يلاحظ وجوده بتركيز عالي في البيئة المحيطة، وذلك لعدم وجود عدد كاف من لويفات السيلولوز لربط الهيمسليولوز ضمن مكونات الجدار (2002 ,Razdan).

أما بعد الزراعة فيتطلب التغير الحادث في مزارع البروتوبلاست نتيجة الأقلمة للظروف الجديدة وإصلاح الضرر الواقع عقب نزع الجدار الخلوي وتكوين الجدار الجديد مكونات بيئية محددة تتلاءم مع العمليات الأيضية الجديدة. فعلى سبيل المثال وكما ذكر سابقاً لابد من خفض قيمة الضغط الاسموزي تدريجيا إما بإضافة بيئة جديدة ذات ضغط اسموزي منخفض أو باستعمال مواد ذات ضغط اسموزي مرتفع لكنها تدخل في عمليات التمثيل مثل السكروز فينخفض مقدار الضغط الاسموزي للبيئة تدريجيا. كذلك تقل الحاجة للأوكسينات تدريجاً حيث تتطلب المزرعة في البداية تركيز عالي منها لدفع عملية الانقسام، ويستثنى من ذلك بروتوبلاست النجيليات حيث يحتاج إلى تركيز منخفض من الأوكسين في البداية ثم تركيز مرتفع منها لاحقاً ولتحقيق إمكانية تغير محتويات البيئة فإن البروتوبلاست يزرع في بيئة سائلة في البداية. ويثبط الضوء الشديد انقسام بروتوبلاست خلايا ميزوفيل أوراق الدخان لذا يفضل زراعة البروتوبلاست عموماً في الظلام ثم ينقل بعد ذلك للضوء (1996 ,Bhojwani &Razdan).

5. زراعة البروتوبلاست

يدخل البروتوبلاست في سلسلة من الانقسامات في بيئة الزراعة الجديدة ليكون كتلا جديدة من خلايا الكالس. وقد أمكن توجيه هذه الانقسامات في بعض الأنواع لتكوين أجنة جسدية تتكشف إلى نباتات كاملة كما في الشكل التالي. واستخدمت هذه الظاهرة بنجاح في التحسين النباتي لبعض النباتات بتحوير المحتوى الوراثي للبروتوبلاست قبل اعادة تكوين الجدار الخلوي والانقسام حيث يمكن إدخال البلازميد إلى البروتوبلاست وتختلف زراعة البروتوبلاست عن زراعة الخلايا النباتية من حيث ضرورة استعمال بيئة ذات ضغط اسموزي مرتفع، والفرق الثاني هو اختلاف عمليات الأيض والتكشف في مزارع البروتوبلاست عن مزارع الخلايا حيث تتم إعادة تكوين الجدار الخلوي وانقسام الخلايا وتكون الكالس قبل التكشف ولابد من ضمان وجود عدد من المركبات العضوية أو بعض المواد المغذية المعقدة التركيب الهامة في إعادة تكوين الجدار الخلوي، وعلى هذا يلاحظ الاختلافات التالية في مكونات بيئة زراعة البروتوبلاست (2005 .Veilleux et al):

شكل يبين: توالى انقسام البروتوبلاست في الصف العلوى ثم تكوين الكالس (أسفل يسار) وتكوين الأجنة الجسدية وإنبات نباتات البرسيم الحجازي (أسفل وسط ويمين) (www.medicago.com)

1. تعتبر الأمونيا مهمة لانقسام الخلايا لكنها عند تركيز 20 مليمول تعتبر سامة للبروتوبلاست وتقلل من حيوية البروتوبلاست. ولذا بجب خفض تركيزها الى نصف أو ربع التركيز الشائع في البيئات المعتادة.

2. احتوائها على ضعف التركيز المستعمل في زراعة الأنسجة من الحديد والزنك.

3. زيادة تركيز الكالسيوم بمعدل 2:4 مرات لمنع تجمع البروتوبلاست في كتل بنية اللون في المراحل الأولى من الزراعة، على أن يتم خفض تركيز الكالسيوم عقب تكوين الجدار الخلوي واستهلال الانقسام.

نظرا للحساسية الشديدة للبروتوبلاست لمكونات البيئة لابد من تلافي وجود بعض المواد التي قد تسبب سمية مثل الآجار والذي يستعاض عنه باستعمال الأجاروز عالي النقاوة. يجب ان تتم زراعة وتداول البروتوبلاست في الظلام أو ضوء شاحب لحساسيته الشديدة للضوء. وتتم الزراعة في البيئة المغذية شبه الصلبة والتي تبدو أنها أفضل لنموه حيث يوفر ثباتها الظروف المثلى للنمو والتطوير. ولكن على الرغم من هذه الحقيقة فإن (1996) Bhowani & Razdan يوضح بعد استعراض العديد من الدراسات اربعة أسباب لاستخدام البيئة السائلة في زراعة البروتوبلاست وهي:

أ. لا ينقسم بروتوبلاست بعض الأنواع النباتية في البيئة المتصلبة.

ب. يمكن بسهولة خفض الضغط الأسموزي للبيئة بعد عدة أيام من الزراعة بتخفيف البيئة.

ج. بفرض تخليق بعض المواد الضارة التي ربما تسبب قتل البروتوبلاست أثناء إعادة تكوين الجدار الخلوي والنمو فإن استعمال البيئة السائلة يقلل من هذا الضرر.

د. يمكن التحكم في كثافة البروتوبلاست عقب الزراعة كذلك إمكانية عزل بعض الخلايا ذات الصفات الخاصة عقب تكوين الجدار بعد عدة أيام من الزراعة، وإن كان هناك صعوبة في فصل المستعمرات الفردية حيث يميل البروتوبلاست إلى التجمع في صورة مجموعات. وتتم زراعة البروتوبلاست في كلتا البيئتين بعدة طرق منها:

1. زراعة البروتوبلاست في صورة معلق في طبقة رقيقة جدا من البيئة السائلة في طبق بترى.

2. زراعته في طبق بتري في شكل قطرات دقيقة جدا بحجم 100-200 ميكروليتر.

3. الزراعة فيما يعرف بالنقطة المعلقة وحجمها 10 - 100 ميكروليتر على السطح الداخلي لغطاء طبق بترى.

4. الزراعة في بيئة سائلة فوق بيئة شبة صلبة.

5. استعمال المزرعة الحاضنة إذا كان هناك ضرورة لزراعة البروتوبلاست في صورة فردية كأن تتم الزراعة بعد دمج البروتوبلاست أو الرغبة في انتخاب طراز معين من البروتوبلاست بعد إجراء تعديل وراثي. حيث يتعارض ذلك مع ضرورة زراعة البروتوبلاست بكثافة تتراوح بين خمسة الاف إلى مليون لكل مليليتر واحد من البيئة والتركيز الأمثل للزراعة هو خمسون ألف حتى يتسنى للبروتوبلاست الانقسام والنمو. ولتحقيق ذلك يمكن تقليل حجم المزرعة جداً باستعمال القطرات الدقيقة المعلقة. أما الطريقة الأخرى فهي استعمال المزرعة الحاضنة التي تمكن العدد القليل جداً من البروتوبلاست من النمو والانقسام حيث تقوم المزرعة الحاضنة بمده بالعناصر المغذية ومتطلبات النمو الأخرى. وغالباً ما تكون هذه المزرعة هي نفس الخلايا التي استعملت كمصدر للبروتوبلاست بشرط أن تكون في حالة نشطة من النمو مع ضرورة الفصل الميكانيكي بين المزرعة الحاضنة والبروتوبلاست ويتم ذلك إما بوضع غشاء فاصل بين الاثنين أو خلط هذه الخلايا مع البروتوبلاست، بشرط وجود ما يميزها كاحتوائها على صبغة لا توجد بالبرتوبلاست كما استعملت خلايا معرضة للإشعاع لتثبيط انقسامها أو استعمال راشح نمو المعلق الخلوي حيث أنه يحتوي أيضا على المواد اللازمة للنمو.

6. الزراعة في بيئة صلبة وهو ما يعرف بـ Bergmann cell plating technique عن طريق خلط كمية من معلق البروتوبلاست تركيزها يساوى ضعف التركيز النهائي المطلوب من البروتوبلاست مع البيئة المستعملة للزراعة على أن تكون محتوية على ضعف التركيز النهائي من الأجاروز والمواد الأخرى. ويتم الخلط برفق والبيئة على درجة حرارة 45°م ثم تصب في طبقة رقيقة في أطباق بترى وتغلق ثم تحضن وبعد نجاح تكوين المستعمرات يتم فصلها وزراعتها بصورة فردية. ويلاحظ توقف انقسام البروتوبلاست في بيئة الزراعة إذا لم يتم تعديل الضغط الاسموزي عقب الانقسامات الأولى للخلية.

وكما أن هناك حد أدنى من الكثافة لزراعة البروتوبلاست فهناك أيضا حد أعلى حيث يجب ألا تزيد كثافة الزراعة عن مليون بروتوبلاست لكل مل من البيئة. حيث تؤدى زيادة التركيز إلى زيادة عدد البروتوبلاست غير السليم والتنافس على مكونات البيئة. ويجب التنويه إلى أنه لا يمكن معالجة عدم النقاوة بزيادة عملية التنقية حيث يسبب ذلك ضرر للبروتوبلاست السليم.

يمكن التعرف على نجاح زراعة البروتوبلاست من السلوك المبدئي له أثناء الإعداد للزراعة وأول هذه الملاحظات هي بدء التحول من الشكل الكروي المميز للبروتوبلاست وحدوث انتفاخ للخلية مما يعكس النشاط التمثيلي وبدء تكوين الجدار الخلوي الشكل التالي. ويمكن الاستدلال على تكوين الجدار الخلوي بالصبغات المميزة لمكونات الجدار وتحدث هذه العملية خلال 2-4 يوم من الزراعة طبقا للنوع النباتي. ويحدث الانقسام الأول للخلية بعد ذلك بفترة وجيزة من تكوين الجدار، ومن الثابت عدم الانقسام إلا عقب تكوين الجدار، وبفشل تكوين الجدار يلاحظ برعمة البروتوبلاست وربما زيادته في الحجم عدة مرات وتعدد النويات ويعد عدم الغسيل الجيد للبروتوبلاست واحتواء المعلق البروتوبلاستى على بروتوبلاست حي وآخر ميت تتحرر منه بعض المواد الضارة أحد اسباب فشل الانقسام. وإذا كان عدد البروتربلاست الذي مات قبل الزراعة كبير فلابد من تخفيف البيئة المستعملة لنضمن بالتالي تخفيف تركيز المواد السامة في البيئة.

شكل يبين: انقسام البروتوبلاست عقب عزله ويلاحظ البروتوبلاست الكروي في أعلى الصورة يمين وأسفل يسار ومرحلة مبكرة من الانقسام أعلى يسار. أما في أسفل الصورة يمين بروتوبلاست وقد كون الجدار الخلوي وتم الانقسام (2005 ,.Veilleux et al).

ويلاحظ تكوين مستعمرات فردية ناتجة من انقسام البروتوبلاست خلال 3-6 أسابيع من الزراعة التي يمكن فصلها وزراعتها بصورة فردية. كما سبق القول يتمكن بعض البروتوبلاست عقب الزراعة من الانقسام وتكوين مستعمرات فردية ويطلق على النسبة بين البروتوبلاست الذي تمكن من النمو والانقسام والعدد الكلي للبروتوبلاست المنزرع مصطلح كفاءة الزراعة plating efficiency وتختلف هذه النسبة باختلاف الأنواع والطرز الوراثية حتى شديدة القرابة وكذلك طريقة العزل والزراعة، وغالبا ما تكون هذه النسبة منخفضة. وقد أورد (1996) Bhojwani & Razdan العشرات من الدراسات حول استخدام مزارع البروتوبلاست في الإكثار الدقيق.