دمج البروتوبلاست وإنتاج الهجن الجسدية

حتى بداية السبعينيات من القرن الماضي لم تكن هناك طريقة لنقل صفة وراثية من نبات إلى آخر سوى التهجين الجنسي حتى استطاع (1970) .Power et al إجراء أول عملية دمج بروتوبلاستي بين بروتوبلاست الذرة والشوفان وبالرغم من فشل هذه المحاولة في الحصول على نبات بعد الدمج إلا أنها كانت بمثابة بداية تطوير هذه التقنية واستخدامها في التحسين الوراثي للنبات، إذ استطاع بعدها (1972) Carlson et al بالتعاون مع آخرين الحصول على أول نبات هجين باستعمال الدمج بين بروتوبلاست Nicotiana Glauca و N. Langsdorffii. وفى عام 1978 كان النجاح العملي لهذه التقنية على يد (1978) .Melchers et al بالتغلب على عدم التوافق الموجود بين الأجناس والحصول على هجين جسدي سمى Pomato ناتج من تهجين جنسين مختلفين هما البطاطس Solanum Tuberosum والطماطم Lycopersicum esculentum لكن كانت كل النباتات الناتجة عقيمة.

وتجدر الإشارة إلى أنه من الممكن حدوث دمج تلقائي للبروتوبلاست أثناء العزل حيث يلاحظ وجود خلايا عديدة الانوية وبالفعل تم تأكيد ذلك بالفحص الدقيق بالمجهر الإلكتروني، لكن معدل النجاح بالاعتماد على الدمج التلقائي ضعيف جدا. وقد ساهمت التقنية الحديثة في زراعة الأنسجة من استعمال زراعة الخلايا والبروتوبلاست والذي يعتبر أصغر وحدة حية من النبات في التحسين الوراثي لبعض النباتات الهامة اقتصاديا. حيث يمكن إجراء الدمج الخلوي الشكل التالي والتحول الوراثي والانتخاب على مستوى البروتوبلاست 2001 ,Johnson & Veilleux) و (2002 ,Rakoczy-Trojanowska) ونظرياً يمكن دمج أي نوعين من البروتوبلاست إذا توفرت الظرف الملائمة لذلك بصرف النظر عن مصدر البروتوبلاست. ويمكن عن طريق هذه التقنية تحقيق الكثير من المميزات والتي قد تكون مستحيلة بالطرق التقليدية ومن تلك التطبيقات:

1. إمكانية نقل صفات هامة كمقاومة إجهاد بيئي أو حيوي من نبات إلى آخر والتي قد لا يمكن أن تتحقق بالتهجين الجنسي. فعلى سبيل المثال تم الحصول على هجين مقاوم لبعض الأمراض باستعمال بروتوبلاستSolanum tuberosum  و S. Brevidens وكذلك هجن Brassica مع أحد الأجناس البرية التابعة لها مقاوماً لبعض الأمراض الفطرية والبكتيرية. أما الهجين الجسدي للطماطم مع البري L. peruvianum فقد كان مقاوماً للصقيع. وقد عدد (2000) Chawla هذه الهجن الضمن أربعين هجينا مختلفا تم الحصول عليها بدمج البروتوبلاست لنقل الصفات المقاومة للأمراض، الحشرات، الملوحة، مبيدات الحشائش وكذلك زيادة إنتاج بعض المركبات الثانوية، ويوضح الجدول التالي بعض هذه الهجن.

شكل يبين: رسم تخطيطي يبين اندماج نوعين مختلفين من البروتوبلاست لتكوين هجين جديد.

2. إمكانية الحصول على نباتات رباعية العدد الكروموسومي وكذلك النباتات الشبيه بالثنائي Amphidiploids في حالة صعوبة ذلك باستعمال الكوليشيسين.

3. الحصول على هجن من نباتات تحمل صفة العقم الذكرى أو من نباتات ذات أعضاء جنسية غير تامة التكوين. فقد أمكن بدمج بروتوبلاست نباتات بطاطس أحادية متضاعفة بها صفة العقم الذكري الحصول على نباتات رباعية خصبة.

جدول يبين: بعض الهجن ذات الصفات الجديدة والتي تم الحصول عليها من دمج بروتوبلاست انواع مختلفة (2000 ,Chawla).

4. التهجين بين نباتات غير بالغة والتي تصل إلى النضج الجنسي بعد مدة طويلة وهي نقطة هامة في تربية النباتات.

5. من المعروف في الإكثار الجنسي انتقال السيتوبلازم للنسل الجديد من النبات الأم فقط عبر البويضة أما حبة اللقاح فلا تحمل عضيات السيتوبلازم. وفي المقابل يتم نقل سبتوبلازم كلا الأبوين إلى النسل في الدمج البروتوبلاستي، فيمكن بذلك نقل بعض الصفات كالمقاومة لبعض المبيدات أو العقم الذكرى التي قد توجد في عضيات سيتوبلازم (الكلوروبلاست والميتوكوندريا) من كلا الأبوين إلى النسل. وغالباً يتم تكوين اتحادات جديدة من المادة الوراثية للميتكوندريا، وعلى العكس يندر تكوين هذا الاتحادات الجديدة للمادة الوراثية الموجودة بالكلوروبلاست (1996) Bhojwani & Razdan. لكن يحدث إعادة انعزال جديدة حيث يحدث استبعاد لكلوروبلاست أحد الأبوين وبهذا ينتج تركيب جديد يحمل بعض الصفات الوراثية لكلا الأبوين ويمكن استبعاد نواة أحد الأبوين بالإشعاع مثلا ويسمى الناتج في هذه الحالة بـ Cybrids إذا لم يحدث دمج للنواتين أو Cytoplasmic hybrids إذا تم دمج النواتين بمعنى أخر يمكن الحصول على هجين سيتوبلازمي في خطوة واحدة دون الحاجة إلى إجراء 8 - 12 دورة من التلقيح الرجعي. ويوضح جدول التالي بعض الهجن التي تم الحصول عليها من دمج بروتوبلاست أجناس مختلفة، لكن كل هذه الهجن كانت عقيمه ولم تنتج بذور. لكن حتى بفرض وجود طرق مثلى لعملية العزل والدمج فإن هناك العديد من المشاكل والصعوبات التي تحد من استخدام تلك التقنية بغرض التحسين وهي:

1. صعوبة عملية الانتخاب بعد التهجين واحتمال عدم وجود طريقة لإحداث التكشف بعد الدمج.

2. قد يكون الناتج النهائي لعملية التهجين غير متزن غالباً كأن يكون عقيم أو به خلل تركيبي أو غير ثابت خاصة لو تم بين آباء بعيدة من الناحية التقسيمية. أو حتى باستعمال خلايا في مراحل مختلفة من التطور.

3. نمو کالس به كيميرا بدلاً من الهجين إذا لم يتم الدمج النووي عقب دمج البروتوبلاست وتنقسم كل نواة مستقلة عن الأخرى وقد تفقد الكيميرا بعد ذلك أثناء التكشف.

4. التهجين بين نباتين ثنائيين ينتج عنه نباتات Amphidiploid غير مرغوبة في برامج التربية ويمكن التغلب على ذلك بتهجين خلايا أحادية.

5. الناتج الوراثي لعملية التهجين متباين غالباً ويرجع ذلك إلى الاستبعاد الكروموسومي، الانتقال، الانعزال في بعض عضيات السيتوبلازم مثل البلاستيدات والميتاكوندريا.

6. انخفاض الثبات الوراثي في مزارع البروتوبلاست كما أنه ليس من المؤكد أن تعبر الصفة محل الاهتمام عن نفسها في النسل.

جدول يوضح بعض الهجن التي تم الحصول عليها من دمج بروتوبلاست أجناس مختلفة (2000 ,Chawla)

طرق دمج البروتوبلاست

قبل البدء في دمج البروتوبلاست لابد من التأكد من وجود البروتوبلاست الحي وبعدد وفير لضمان حدوث الدمج بنجاح. ولا يتوقف الأمر عند ذلك بل هناك الكثير من الصعوبات العملية التي تعيق هذه العملية خاصة كلما قلت درجة القرابة بين النوعين. فبالرغم من أن الغشاء البروتوبلاستي غير قوى التركيب بالمقارنة مع الجدار الخلوي إلا أنه لا يزال يشكل عقبة ميكانيكية في سبيل الدمج البروتوبلاستي. وفي الحقيقة يميل بروتوبلاست بعض الأنواع الدخان إلى الاندماج بسهولة بمجرد رفع الرقم الهيدروجيني إلى 5.10 مع وجود تركيز عالي من أيونات الكالسيوم. (1974 ,Melchers & Labib)، لكن هناك بعض الأنواع يصعب دمجها. ولكي يتم الدمج لابد أولا أن يكون البروتوبلاست ملاصقا للآخر في مجموعات لا يزيد فيها البعد بين البروتوبلاستيني عن 10 انجستروم. لذا يحب التخلص من الشحنات الكهربائية الموجودة على الغشاء والتي تتراوح بين - 10 و - 30 مليفولت مسببا تنافر البروتوبلاست.

وذلك مع مراعاة العمل على عدم ثبات تركيب الغشاء لوقت قصير لتتكون قنطرة بين البروتوبلاستين تسمح بمرور السيتوبلازم من ناحية إلى أخرى أو يتم اتساع المنطقة المتهتكة بين الغشائين فيتم الدمج . ثم تأتى المرحلة الثالثة بإعادة الغشاء إلى وضعه ويسمى الناتج من هذه العملية fusion product أو heterokaryons. وإذا حدث الدمج بين النواتين عقب ذلك سمى الناتج هجين hybrid. وتعتبر عملية الدمج عملية غير متخصصة بمعنى أنه لا يمكن معرفة أي من البروتوبلاست الذي سيتم دمجه وليس هناك ما يمنع من أن يتم دمج بروتوبلاستين أو أكثر من نفس الأب ليكون homokaryon وربما لا يتحقق الهدف من الدمج بين النوعين محل التجربة.

يتم الدمج باستعمال طريقة كيميائية تعتمد على زيادة تركيز أيونات الكالسيوم في وجود البولي إثيلين جليكول (1982 ,Benbadis&Virville) أو بعض المواد الأخرى مثل polyvinyl acetate أو بعض اللبيدات، ويجب التخلص من هذه المواد عقب الدمج مباشرة. يعمل PEG على التخلص من الشحنات السالبة ونزع الماء جزئياً من البروتوبلاست ثم تحدث هجرة للبروتينات المكونة للغشاء الخلوي فتتكون منطقة غنية في اللبيدات تسبب تلاصق البروتوبلاستين مع بعضهما وتستغرق هذه الخطوة 15-30 دقيقة. وبرفع تركيز أيون الكالسيوم إلى 50 مليمول من CaCl₂.2H₂O في وسط قلوي يصل إلى 9 - 10 يتم الدمج وبمعدل قد يصل إلى 100%. وتعتبر طريقة (1974) Kao & Michayluk المعتمدة على هذه الفكرة الاكثر استخداماً حتى الآن، ومع ذلك فإن الآلية الدقيقة للدمج بهذه الطريقة غير معروفة بدقة (1996) Bhojwani & Razdan . لكن يعيب هذه الطريقة صعوبة دمج نوعين مختلفين من البروتوبلاست وحدوث معظم الدمج بين نفس البروتوبلاست. كما أن PEG يعتبر سام للخلايا، وقد سجل خلل في تركيب الميتاكوندريا عند دمج بروتوبلاست بعض الأنواع (1985 Bates,) وكذلك يقلل من انقسام وتكشف البروتوبلاست بعد الدمج إن لم يتم التخلص من مخلوط الدمج بدقة قبل الزراعة. ولهذا السبب وبالرغم من انخفاض تكاليف هذه الطريقة بالمقارنة مع الطريقة الكهربائية إلا أنها أقل استعمالاً منها.

أما الطريقة الأخرى والتي كان أول استخدام لها بواسطة .Senda et al (1979) وتعرف بطريقة الدمج الكهربائية electrofusion. وهي طريقة سهلة وسريعة فلا تستغرق إلا 15 دقيقة. ويمكن بواسطتها التحكم في إحداث الدمج بين نوعين مختلفين من البروتوبلاست فقد استطاع (1990) .Jones et al الحصول على 12.3% من الأشطاء الهجين بين Solanum tuberosum و S. brevidens بينما كانت هذه النسبة 2.6% باستعمال PEG. أضف إلى ذلك ما أشار إليه .Asao et al (1994) من ارتفاع معدل الخصوبة للنباتات الناتجة بالدمج الكهربائي. وكما هو الحال في الطريقة الكيمائية فإن الدمج يحدث في مرحلتين الأولى هي إحداث تجمعات من البروتوبلاست في شكل سلسلة سبحية بين القطب السالب والموجب والثانية هي دمج الأغشية مع بعضها كما في الشكل التالي.

شكل يبين تلاصق بروتوبلاستين كمرحلة سابقة لعملية الدمج على اليمين. وعلى اليسار يلاحظ حدوث اتصال تام بين الغشاءين السيتوبلازميين ودمج البروتوبلاستين معاً Gürel et al., 2002.

ويتم ذلك بوضع البروتوبلاست في غرفة صغيرة تحمل على شريحة مجهرية. يتصل بالغرفة محقن مجهري به البروتوبلاتست المنتشر في وسط ذو توصيل كهربي ضعيف واسموزية عالية كالمانيتول. ويتم تعقيم الحجرة بتيار من الكحول لمدة 10 دقائق قبل غسلها بعناية بواسطة الماء المقطر المعقم. ويتم توفير فرق جهد كهربائي متغير بين طرفي الحجرة باستعمال قطبين من البلاتين المسافة بينهما 200 ميكروميتر. بعد وضع البروتوبلاست بين القطبين يتم توليد فرق جهد عالي تردده (0.5 و 1.5 ميجاهرتز) وبفرق جهد 10 - 200 فولت /سم2. وبذلك يصبح الغشاء مشحون بشحنات كهربائية وتنجذب الأغشية ذات الشحنات المختلفة إلى بعضها البعض وتصبح موجودة في شكل حبات العقد. وبمجرد الحصول على هذه الحالة يتم استحداث نبضة أو اثنتين (10 - 20 ثانية) من تيار ثابت وبفرق جهد عالي (0.125 - 1 كيلو فولت/سم2) حيث يسبب ذلك إلى خلل في تركيب الغشاء وإحداث ثقوب به تمكن من دمج البرتوبلاستين معا. ويمكن رفع معدل الدمج إلى 60 % (1990 ,Lindsey & Jones) بمعاملة البروتوبلاست قبل الدمج بمحلول كلوريد الكالسيوم ومنظم النمو spermine.

وأخيراً بقى القول إن الدمج بتلك الطريقة أكثر نجاحاً مع البروتوبلاست المعزول من خلايا تحتوي على الكلوروبلاست دون ذلك الذي مصدره الكالس أو الجذور. ورغم كل ما سبق فإن الدمج باستعمال الطريقة الكيميائية ما زال واسع الاستعمال. وللمزيد حول هذه التقنية راجع (1996) Bhojwani & Razdan.

انتخاب الهجن الجسدية

بفرض وضع نوعين مختلفين من البروتوبلاست في الظروف المثلى للدمج فإن ناتج العملية سيكون الدمج بين نفس البروتوبلاست ، النوعين المختلفين من البروتوبلاست وقد يتم الدمج بين واحد أو أكثر من البروتوبلاست الموجود، وبعض البروتوبلاست غير المندمج. وتعتمد عملية إنتاج الهجين الجسدي في أصلها على وجود النواتين المختلفتين وهو ما يعرف بـ heterokaryons عقب دمج البروتوبلاست ولا يتعدى معدل ذلك 0.5-10 %، والأكثر من ذلك فإن نسبة بسيطة من هذا الناتج يتم فيه اندماج النواتين للحصول على هجين فريد في نوعه، قد يعيقها العديد من التعقيدات التي تلي الاندماج الناجح. وتعتبر عملية انتخاب الهجين الجسدي الثنائي Binary fusion في غاية الصعوبة، حيث يصعب استعمال الانتخاب لبعض الطفرات والمضادات الحيوية وهي الطريقة الشائعة في زراعة الخلايا الحيوانية. وعلى الرغم من ذلك استعملت بعض الطفرات مثل الالبينو في الانتخاب على مستوى النبات بعد التكشف وبذلك تتجنب عملية الانتخاب في مرحلة البروتوبلاست.

ويعتبر الانتخاب اليدوي هو الأكثر استخداما، والذي يعتمد على احتواء كل نوع من البروتوبلاست على صفة مميزة مثل الكلوروبلاست أو حبات النشا والتي يمكن تميزها بسهولة باستعمال المجهر. ويمكن تحقيق ذلك باستعمال بروتوبلاست معزول من أوراق أو بتلات أحد الآباء، وبرتوبلاست الأب الآخر والذي يتم الحصول عليه من المعلق الخلوي أو من أجزاء غير ملونه كدرنات البطاطس (2002 ,Razdan).

وللحصول على بروتوبلاست به وفرة من حبات النشا يتم تنمية المعلق الخلوي في بيئة غنية في الكربوهيدرات. بذلك يمكن تحديد ناتج البروتوبلات المندمج المحتوى على الصفتين المعروفتين سابقا. بعد ذلك يتم عزل البروتوبلاست المندمج باستعمال ماصة أو الأجهزة الحديثة التي تعتمد على قياس الطيف الضوئي. وبالرغم من أن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا إلا أنها تمتاز باستبعاد ناتج الدمج إذا كان يحتوي على أكثر من بروتوبلاستين. وإذا تم نجاح دمج أنويه الأبوين فإن الناتج يطلق عليه somatic hybrid وبعد انتخاب البروتوبلاست المندمج والنجاح في دفعه للتكشف وتكوين نباتات لابد من التأكد من توريث صفات الأبوين للنسل ويتم ذلك بعدة طرق منها:

1. وجود صفات مورفولوجية وسطية بين كلا الأبوين مثل ارتفاع النبات، شكل أو الأوراق أو لون الأزهار. لكن لا يعول كثيرا على هذه الصفات حيث أنها تتأثر بالبيئة وبظروف الزراعة المعملية أيضاً وبدرجة الفعل الجيني المتحكم في الصفة.

2. إذا كانت كروموسومات الأبوين مختلفة من حيث الشكل المورفولوجي فيمكن تمييز الهجين عن طريق الفحص السيتولوجي Karyotype analysis، لكنها عملية صعبة. ويوضح الجدول التالي أعداد الكروموسومات في بعض الهجن الجسدية. ومن الجدول يلاحظ أن النباتات الناتجة من الدمج بها تباين كبير في أعداد الكروموسومات وغالباً ما تحتوي على عدد من الكروموسومات أكبر من العدد الكلى للأبوين يرجع ذلك لحدوث دمج لأكثر من بروتوبلاست خليتين معا والذي قد يتبعه عدم اتزان في الانقسام الخلوي، أو بسبب الاختلاف في سرعة تضاعف الـ DNA للأبوين بعد الدمج، بالإضافة إلى تأثير زراعة الأنسجة نفسه على حدوث تباين وراثي.

3. أما الطريقة الأكثر دقة فهي التحليل الإنزيمي Isoenzyme analysis وأساس هذه الطريقة أن للإنزيم تتابع محدد من الأحماض الأمينية. ويكون هناك فرق ضئيل جدا بين الآباء في هذا التتابع لكنه كاف لإظهار الفرق بينهم، ويتغير سلوك البروتين أثناء هجرته عند تعرضه لفرق جهد كهربائي electrophoresis حيث يتم الحصول على حزم مختلفة بعد الصبغ بالصبغات الخاصة المميزة لكل إنزيم. وقد يحتوي الهجين على حزم جديدة لم تكن موجودة في أي من الأبوين. ومن الإنزيمات التي تستعمل غالباً لتحديد التهجين esterase و peroxidase و alchol dehydrogenase. لكن تبدو مشكلة الاعتماد على هذه الطريقة في اختلاف تركيب الإنزيم باختلاف النسيج واختلاف مرحلة تطور النبات نفسها.

4. الاعتماد على وجود مركبات ثانوية مميزة لأب معين.

5. وجود ظاهرة قوة الهجين heterosis فعلى سبيل المثال عند نجاح التهجين الجسدي بين Datura inoxia المميزة بعدم وجود الكلوروفيل وD. sanguinea المميزة بوجود الكلوروفيل يلاحظ أن النسل يمتاز بقوة النمو حتى على مستوى الخلايا.

6. أما الطرق الأكثر دقة فهي المعتمدة على التقنيات الجزئية Molecular techniques والتي تسمى تهجين DNA hybridization technique.

جدول يبين: أعداد الكروموسومات في بعض الهجن الناتجة عن دمج البروتوبلاست (Chawla, 2000).