يبصرنا التطفير الموجه بالموقع الفعال بحقيقة آليات عمل الإنزيمات

تؤمن طرق البيولوجيا الجزيئية وسائل فعالة جدا لاستقصاء ألية عمل الإنزيمات، ومن أهمها قابلية تبديل التسلسل النوكليوتيدي للجينات وتخليق البروتينات في مضيف وحيد الخلية كخلايا الثدييات المزروعة أو جرثومة الإشريكية القولونية. وبمشاركة نتائج تصوير البلورات بالأشعة السينية لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد مع الاستقصاءات الحركية التقليدية، فإن هذه الطرق الجزيئية تؤمن معلومات قيمة ومفصلة حول الآليات التي تؤثر بها الإنزيمات.

عندما تشير المعطيات الفيزيائية والحركية إلى قيام ثمالة حمض أميني ما بوظيفة نوعية في التحفيز (أي تقوم بالعمل كقاعدة (أساس) عامة أو كعامل ناقل لمجموعة كيميائية)، فإنه مكن إثبات هذا الاستنتاج بتبديل الحمض الأميني بآخر عاجز عن إنجاز الوظيفة المفترضة؛ ويمكن في بعض الحالات تحقيق ذلك بالتعديل الكيميائي للإنزيم. ولكن الطريقة الأعم هي استخدام التطفير الموجه بالموقع الفعال Site-directed mutagenesis لإحداث طفرة في الجين الذي يرمز الإنزيم ثم نقل الجين للتعبير عنه وتحديد صفات الإنزيم المتبدل بالطفرة. وبتبديل تسلسل القواعد لتشفير كودون (Codon) نوعي، يستطيع التطفير الموجه بالموقع الفعال إحلال أي حمض أميني بروتيني مرغوب فيه مكان حمض أميني معين؛ كما يستطيع التطفير الموجه بالموقع الفعال أيضا استبدال الأحماض أمينية متعددة. ويؤخذ أحد قلائل النوكليوتيد القصيرة (Oligonucleotide) (أي 19 مونومرا أو قسيما (19 mer)) المنتج بالتخليق الآلي، والذي يشفر حمضاً أمينياً طافراً، ويثبت (Annealing) في المختبر إلى النمط الشائع (wild-type) من الجين المعزول، ثم ينتج جين طافر بإضافة بوليميراز الدنا (DNA) وليجاز الدنا (DNA) وثلاثي فسفات الديوكسي ريبونوكليوزيد. وينقل هذا الجين الطافر في ناقل (حامل) تعبيري (Expression vector) . وهو ناقل ذو طاقة تكاثر معززة) إلى موقع يقع تحت تأثير معزاز (Promoter) قوي ليعبر عنه (يترجج إلى إنزم). ينقى الإنزيم الطافر بعد ذلك وتدرس خصائصه.