من الضروري معرفة بعض العوامل التي تتعلق باختيار طرائق الفصل والتنقية وقابلية تطبيقها لتوضيح بعض مميزاتها ومساوئها، وغالباً ما تستخدم طريقة واحدة أو عدة طرائق مع الأخذ بنظر الاعتبار ان اختيار الطرائق يعتمد على عدة عوامل مثل الأجهزة والإمكانيات المتاحة في المختبر أو الوقت اللازم للاستخلاص والتنقية. وبصفة عامة فإن الطرائق التي تعتمد على التغيير في الذوبان تكون مناسبة في الخطوات الأولية للتنقية بينما الطرائق المعتمدة على الكروماتوغرافيا (مثل التبادل الأيوني والهجرة الكهربائية تتناسب مع الخطوات النهائية في التنقية وفي بعض الحالات وخاصة عن احتمال حدوث تحلل للبروتين أو احتمال حدوث تغيير في فعالية الإنزيم أثناء إجراء الفصل والتنقية فيجب أن تتم خطوات التنقية بسرعة بقدر الإمكان، ولهذا ففي هذه الحالة تكون الطرائق المعتمدة على الذوبان مناسبة وأسرع من تلك التي تتعلق باستخدام أعمدة الفصل.

ونظراً للتقدم الهائل في طرق التنقية في السنوات الأخيرة فبالإمكان استخدام تقنية الألفة Affinity ورغم هذا التقدم فتوجد عدة إنزيمات يجري فصلها وتنقيتها بالطرائق القديمة مثل الترسيب باستخدام الإيثانول أو كبريتات الأمونيوم، وتستخدم الطرائق التقليدية في الإنزيمات غير المتجانسة أو التي يحدث لها فقدان جزئي النشاط أثناء تنقيتها كما يمكن استخدام أكثر من طريقة للفصل والتنقية مع المحافظة على فعالية الإنزيم. وحيث ان الهدف الرئيسي من التنقية هو الحصول على الإنزيم بأعلى درجة من النقاوة وبأعلى كفاءة ممكنة في درجة فعاليته فعليه توجد عدة طرق للحكم على هذه الخاصية :

1- اختبارات النقاوة Tests of purity

إن معظم الطرائق التي سبق وصفها في عملية الفصل وتنقية الإنزيمات يتم المفاضلة بينها بعمل اختبارات النقاوة للمستحضرات الإنزيمية المحضرة رغم أن الاختبار التحليلي يمكن استخدامه لإثبات وجود الشوائب من عدمه.

وبصفة عامة يجب ان لا تزيد نسبة الشوائب في الإنزيمات المحضرة عن كميات ضئيلة تــصــل الــــى 0.01 % وبهذه النسبة يمكن تجنب الفقدان في فعالية الإنزيمات، وبعض الطرائق الشائعة الاستخدام في هذا المجال موضحة بالجدول (5-13 ) الأتي:

2- الاختبارات على الفعالية التحفيزية للإنزيمات Tests for catalytic activity of enzymes عند اختبار الإنزيمات المحضرة فمن الضروري معرفة الظروف المثلى للتقدير مثلاً وجــود المنشطات والعوامل المتعلقة بالتفاعل مع ضرورة غياب المواد المثبطة ومعرفة الظروف المناسبة لثبات الإنزيم أثناء الخزن.

3- اختبار كفاءة المراكز النشطة Test for active site efficiency

يمكن استخدام هذه الطريقة في معرفة سرعة ظهور نواتج التفاعل ( عند حدوث التفاعل بين الإنزيم ومادة التفاعل)  وإذا كان معدل تحلل المركب الوسطي بطيئاً ففي هذه الحالة يلزم زيادة مراحل وخطوات تنقية الإنزيم حتى يتم التفاعل وتحليل المادة في وقت مناسب، وفقدان الإنزيم لفعاليته معناه عدم استجابة الإنزيم لمادة التفاعل وبالتالي عدم إنتاج نواتج التفاعل وأن زيادة تركيز نواتج التفاعل يدل على مدى فعالية الإنزيم.

مواضيع ذات صلة

أنزيم الكرياتين كاينيز (CK) Creatine Kinase

أنزيم الفوسفاتيز القاعدي (ALP) Alkaline phosphatase

أنزيم GPT

أنزيم GOT

طرائق استخلاص وتحليل الكاربوهيدرات

المصطلحات المستخدمة أثناء عملية استخلاص وتنقية الإنزيمات

طرائق فصل وتنقية الإنزيمات

استراتيجية تنقية الانزيمات

تفاعلات كرة المنضدة (تفاعلات بنك - بونك) Ping- Pong reactions

آلية عمل إنزيم الكايموتربسين

الإنزيمات المنظمة Regulatory (أو الإنزيمات الألوستيرية Allosteric)

الإنزيمات المتماثلة (المتناظرة) الأصل Isoenzymes