تحديد توالي الدنا DNA Sequencing

معرفة توالي النيوكلوتيدات في الجين او اي قطعة من الجينوم يعطي معلومات مهمة حول التركيب والوظيفة والتطور والعلاقات بينها ودرجة التشابه مع جينات أخرى في الكائن نفسه او في كائنات مختلفة. وقد يكون التوالي الناتج هو نسخة أولية Draft Sequence الذي يكون بتغطية غير دقيقة لان هذه يمكن ان تعالج في المراحل النهائية ، وفي هذا التحديد غير المشذب Sequence Redundancy تكون هناك زيادة تصل على الأقل ستة أضعاف ويغطي حوالي 90 % من الجينوم وهذا النوع من التحديد يمكن ان يستعمل عندما يكون بدرجة عالية من النوعية للتعرف على الجينات وغيرها من مظاهر الجينوم دون الحاجة الى العمل التجريبي.
وهناك أكثر من طريقة لتحديد توالي الجينوم منها الطرق الكيماوية مثل طريقة Maxam - Gilbert التي وضعت أسسها عام 1977 وطريقة إنزيمية وهي طريق Sanger التي استعملت عام 1981 .
تعتمد الطرق الكيماوية على فلق جزيئات DNA بواسطة بعض المواد الكيماوية الخاصة. وتستعمل 4 مواد كيماوية في أربع خلائط من التفاعلات كل مادة في خليط، وكل تفاعل ينتج قطع DNA مختلفة الأحجام ويحدد الحجم بموقع النيوكلوتيد الذي تم فلقه في DNA . والمواد الأربعة المتخصصة مثل المادة DMS) Dimethyl Sulfate) تهاجم قاعدة الكوانين وتضيف اليها مجموعة مثيل وحامض الفورميك يحور كل من الأدنين والكوانين، اما الهيدرازين فيحور كل من الثايمين والسايتوزين وعند إضافة تراكيز عالية من الملح( 5 مول) الى خليط التفاعل يصبح التفاعل خاص للسايتوزين ومع هذه المواد يحوي خليط التفاعل على Piperidine التي تقوم بفلق العمود الفقري لل DNA في الموقع القادم للقاعدة المحورة.
وDNA المراد تحديد تواليه يكون بشكل أشرطة مفردة ويعامل الشريط بإنزيم حل الفوسفات القاعدي Alkaline Phosphatase لإزالة الفوسفات عند النهاية ' 5 ثم يلي ذلك تعليم الشريط بالفسفور المشع وذلك بمفاعلته مع ATP حاوي على ³²P وبمساعدة إنزيم فسفرة النيوكلوتيدات المتعددة Polynucleotide Kinase الذي يربط الفسفور المشع الى النهاية ' 5. ثم يتم تقسيم نموذج DNA المهيأ للتفاعل الى أربعة أقسام لتتم مفاعلة القواعد النتروجينية بالمواد الخاصة بها كما مذكور أعلاه فضلا عن إضافة Piperidine لفصم السلسلة عند القواعد المحورة. ثم يتم ترحيل كل نموذج في الهلام لتحديد مواقع القواعد النتروجينية في DNA كما موضح في الشكل :
والطريقة تحتاج الى كميات من DNA النقي كما ان عملية إجراءها بشكل آلي غير متوفرة ولكنها لا تزال تستعمل لبعض الأغراض مثل Footprinting.

اما الطرق الانزيمية فهي أكثر استعمالا من طريقة الفلق الكيماوي وتعتمد أساسا على تخليق DNA الذي يتم إيقافه عند وجود نيوكلوتيدات غير طبيعية وهي ddNTP) Dideoxy Nucleotides ) وهي نيوكلوتيدات مضاهية للنيوكلوتيدات الطبيعية الا انه ينقصها OH– على الموقع الكربون ' 3 وعندما تدمج في السلسلة سوف لا يكون هناك OH– '3 في الموقع لإضافة نيوكلوتيد جديد لذا يتوقف التخليق عند هذه النقطة. وDNA المراد تحديد تواليه يكون بشكل أشرطة مفردة ويتم بدء التخليق باستعمال البوادئ وإضافة نوع واحد من النيوكلوتيدات وهي اما ddCTP او ddATP او ddGTP او ddTTP وتكون معلمة ب ³²P في مجموعة الفوسفات. ويمكن استعمال صبغات متفلورة .
وتعتمد الطريقة على اندماج أحد ddNTP في أشرطة DNA النامية باستعمال إنزيم كوثرة DNA Polymerase I وهي تعد من طرق كوثرة DNA خارج الأنظمة الحية، واستعمال القواعد الشاذة تؤدي الى إيقاف او إنهاء التفاعل بعد اندماجها ولذلك تنتج قطع مختلفة الطول التي يتم تحديدها بعد الترحيل الكهربائي اما باستعمال الأنابيب الشعرية او هلام Acrylamide ثم قراءة توالي DNA . وعليه فان خليط التفاعل يتكون من قطعة DNA المراد تحديد تواليها، وبوادئ خاصة ثم يقسم الى أربعة أقسام، تضاف الى كل قسم النيوكلوتيد الشاذ الذي يضاهي النيوكلوتيدات الأربعة الطبيعية. وتتم العملية وفق الشكل :

اما في حالة استعمال الصبغات فتستعمل صبغة خاصة بكل قاعدة وعند الفصل والفحص باشعة الليزر ويمكن ان تكون مخرجات النموذج بالشكل الاتي :

وقد قسمت عمليات تحديد التواليات الى اجيال :
الجيل الاول First Generation وتتمثل بطريقة Maxam – Gilbert و طريقة Sanger المذكورة ، والطرق كما موضح تعتمد على تفكيك القواعد النتروجينية ببعض المواد السامة او المسرطنة كما في الطريقة الاولى او اندماج القواعد النتروجينية المحورة في الطريقة الثانية .
اما طرق الجيل الثاني Second Generation Methods فتعتمد على تخليق اشرطة جديدة مقابل الشريط القالب المراد تحديد تواليه اي انها عمليات تعتمد آلية التخليق SBS) Sequencing by Synthesis) التي طورت عام 2005 ومنها Pyrosequencing المعتمدة على انطلاق PPi بعد اندماج القاعدة النتروجينية واستخدام الاخيرة في تفاعلات انزيمية لاطلاق الضوء وسميت بهذا الاسم ، وكذلك طريقة 454 Sequencing التي تعتمد طريقة Pyrosequencing مع بعض التحويرات البسيطة وطورت في شركةGuraGen Corporation واعطي الاسم لرقم المشروع ولا دالة اخرى للرقم ، وفيها يكون في معظم الاحيان الطور الصلب Solid Phase المستعمل بشكل حبات الخرز ويكون الاعتماد ايضا على قياس الضوء المنطلق ثم تبنتها شركة Roche

وطرق الجيل الثالث Third Generation Methods فتشمل تقريبا كل التقنيات التي ظهرت بعد طريقة Sanger وMaxam – Gilbert ، ولا تزال طريقة Sanger هي الافضل المعتمدة في العديد من المختبرات ومراكز البحوث وامكن تطويعها الى الوضع الآلي وذلك لانها تعطي مقروءات Reads هي الاطول من بين الطرق الاخرى . اما الطرق الحديثة NGS) Next Generation Sequencing ) فيمكن ان تحدد تواليات جينوم كامل على شكل مقروءات ولكن المشكلة تاتي من تجميع هذه المقروءات للحصول على توالي جينوم كاملوحتى  مع استعمال حواسيب كفؤة ومتطورة (على الاقل في الوقت الحاضر ) .