مكونات بيئات النمو المستعملة في زراعة الأنسجة (المكونات غير العضوية Non organic components)

يمتص النبات الكامل وكذلك الأنسجة والخلايا في مزارع الأنسجة العناصر الغذائية في صورة أيونات، وعادة يتم إضافة العناصر المغذية في صورة أملاح حيث تتأين في البيئة. ويتم امتصاص بعض العناصر في مزارع الأنسجة في صورة كاتيونات مثل Ca²⁺ و K⁺ و Mg²⁺ وبعضها في صورة أنيونات مثل Cl^- و SO₄^- و H2PO4- أما النتروجين فيمتص في صورة كاتيون الأمونيا NH₄^- أو أنيون النترات - NO3. وتعتبر عملية اختيار التركيز الأنسب من الأيونات المختلفة وكذلك الاتزان الأيوني بين الأيونات وبعضها البعض، بالإضافة إلى التركيز الكلي للأيونات في البيئة من أهم العوامل المؤثرة في نجاح زراعة الأنسجة. هذا مع الأخذ بعين الاعتبار الرقم الهيدروجيني للبيئة فهو المحدد الأساسي لتيسير العناصر ولما كانت الخلايا النباتية في مزارع الأنسجة على العكس من النباتات في المزارع المائية تتحمل تركيزات عالية نسبياً من Na⁺ و Cl^- دون ضرر فإن هذه الأيونات لا تعطى أهمية كبيرة عند تحضير البيئة ومن ثم تعتبر الأملاح المحتوية على الصوديوم والكلور مصدرا للعناصر الأخرى. لكن قد يؤدى خفض تركيز الكلور مع زيادة الفوسفور والماغنيسيوم إلى تحسين النمو واستمراره لفترة اطول دون الحاجة إلى تجديد البيئة المغذية Gislerod et al., 2005)).

يحصل النبات على العناصر الغذائية عن طريق الانتقال الحر والذي يعرف بالبسيط دون الحاجة إلى طاقة، أو بعملية الانتقال النشط التي تحتاج إلى طاقة. وقد أوضح (1993) Willams أن امتصاص العناصر من البيئة يتناسب مع تركيزها حتى الضعف، لكن قد يختلف الأمر مع بعض العناصر فزيادة تركيز الزنك في البيئة لا يترتب عليها زيادة امتصاصه ، بمعنى أن للعنصر تركيز أمثل في النسيج لا يزيد عنه (1995 ,.Leifert et al) والامتصاص النشط لا يرتبط في غالب الأمر بتركيز الأيون عكس الامتصاص غير النشط الذى يتأثر بتركيز الأيون ودرجة الحرارة والرقم الهيدروجيني، بالإضافة إلى الحالة الفسيولوجية والبيوكيميائية للنسيج. ويجب الإشارة إلى أن ثغور النباتات في مزارع الأنسجة تكون مفتوحة مما يؤهلها لامتصاص المكونات المختلفة للبيئة (2005 ,le & Winhoven ، على الرغم من تشبع الفراغ المحيط بالنباتات في مزارع الأنسجة بالرطوبة أي أن امتصاص الماء والعناصر من البيئة لا يخضع لنقص الرطوبة في الفراغ المحيط بالنبات كما هو الحال في الظروف الطبيعية حيث تتمتع النباتات في مزارع الأنسجة بقدرة عالية على تدفق الماء عبر انسجتها لأن الثغور تكون مفتوحة غالباً (1999 Beruto et al.). وفيما يلي عرض موجز للعناصر المغذية الكبرى من حيث نوعها وأهميتها والصورة التي تضاف عليها والتركيز الشائع منها في بيئات مزارع الأنسجة وقد ناقش كلا من Bouman & Tiekstra (2005) ,(Leifert et al., 1995), (Pierik, 1987) و (2008 ,George & De Klerk) ذلك باستفاضة.

أ. العناصر المغذية الكبرى Microelements

1. النيتروجين

يدخل النتروجين في تكوين العديد من المركبات العضوية كالبروتين، والأحماض النووية، والبروتوبلازم، والقلويدات. وتظهر أعراض نقصه على صورة اصفرار النبات وتقزم النمو. وتتراوح نسبة النتروجين في النباتات المختلفة من 1.5 - 4 % من الوزن الجاف. ويتأثر النمو والتكشف في مزارع الأنسجة بدرجة كبيرة على مدى تيسر النتروجين والصورة الموجودة منه. وتمتاز الأنسجة المنزرعة بقدرتها على امتصاص النتروجين إما في صورة أمونيا NH4 ⁺ وهي صورة مختزلة أو نترات NO₃ ^- وهي صورة عالية الأكسدة من النتروجين وتدخل أيونات NH₄⁺ بعد امتصاصها مباشرة في عمليات الأيض النباتي أما ^-NO₃ فلابد أن تختزل بنزع الأكسجين وإحلاله بالهيدروجين فتتحول إلى NH₄⁺ قبل دخولها في عمليات الأيض النباتي، وهذه عملية مستهلكة للطاقة. ومن ثم فإن معظم النباتات تحتوي على تركيز أعلى من NH₄⁺ بالمقارنة مع NO3 -. وعلى الرغم من ضرورة اختزال NO3 - قبل دخولها في عمليات الأيض النباتي فإنه يجب إضافتها لبيئة مزارع الأنسجة بل تحتوى أغلب البينات على تركيز عالي من النترات بالمقارنة مع الأمونيا، وذلك للمحافظة على الرقم الهيدروجيني للبيئة والذى يتم ضبطه عند إعداد البيئة ليكون 5.5-5.8 لتجنب التأثير السام لأيونات NH4⁺ في البيئة.

تمتص الأمونيا من البيئة في الوسط القلوي ويصاحب ذلك خروج أيونات الهيدروجين للبيئة فينخفض الرقم الهيدروجيني إلى 4.2-4.6 وعند ذلك يثبط امتصاص الأمونيا ويحفز امتصاص النترات والذي يصاحبه خروج أيونات الهيدروكسيل للبيئة مما يرفع الرقم الهيدروجيني للبيئة ويشجع امتصاص الأمونيا مرة أخرى. وبذلك يحدث اتزان في الرقم الهيدروجيني للبيئة بدون وجود محلول منظم للرقم الهيدروجيني. ولثبات الرقم الهيدروجيني أهمية كبرى ليس فقط لدوره في امتصاص العناصر المختلفة بل للعوامل الأخرى التي سوف توضح لاحقا. وقد وجد أن استهلاك مليمول واحد من الأمونيا في تكوين مادة عضويه يصاحبه خروج حوالي 0.8 - 1.0 بروتون من الهيدروجين إلى البيئة، ولكل استهلاك مكافئ من النترات يخرج 1-1.2 من بروتون الهيدروكسيل إلى البيئة. وبذلك إذا كانت نسبة النترات في البيئة ضعف الأمونيا لا يحدث تغير في الرقم الهيدروجيني للبيئة، لكن لا بد أن يؤخذ في الاعتبار ارتباط الامتصاص بالنوع النباتي. وهناك بعض الأبحاث التي أشارت إلى إمكانية استعمال المحلول المنظم المكون من Na2HPO4 + KH2PO4. ومن الضروري عند إعداد البيئة أن تحدد نسبة NO3 _- / NH4⁺ لتأثير ذلك على بعض الظواهر التالية بالإضافة إلى الرقم الهيدروجيني:

* حفظ اتزان شحنة النسيج والتخلص من H⁺ و OH^- الناتجة من عملية الأيض.

* في بعض الحالات ولسبب غير معروف لا ينمو النسيج إذا احتوت البيئة على NO3^- كمصدر وحيد للنتروجين.

* لوحظت ظاهرة التميؤ الزجاجي والمعروفة بـ hyperhydrisity أو vitrification أو glassiness في الأفرع النامية في بيئة بها الأمونيا مصدر وحيد للنتروجين حيث يسبب ارتفاع تركيز الأمونيا زيادة في معدل التخليق الحيوي للبروتين والأحماض الأمينية وزيادة في معدل استهلاك الكربوهيدرات وتصبح الأفرع (كما في الشكل رقم 1) مكتنزة بالماء ورخوة ولها مظهر زجاجي وسهلة الكسر . وغالباً تفقد تلك الأفرع القدرة على النمو الطبيعي والتضاعف والأقلمة، وبذلك لا يمكن استعمالها في الإكثار مرة أخرى. وقد اختفت هذه الظاهرة في مزارع أنسجة بعض النباتات عندما أضيفت النترات للبيئة. وعلى العموم تتضح أعراض نقص النتروجين على النسيج باستعمال الأمونيا أو النترات كمصدر وحيد للنتروجين دون وجود محلول منظم للرقم الهيدروجيني من بعض الأحماض العضوية ثلاثية الكربوكسيل كالسكسنك.

* كما سبق القول يعتبر وجود أيونات الأمونيا والنترات أحد العوامل الأساسية التي تحافظ على ثبات الرقم الهيدروجيني للبيئة حيث يعمل كلا منهما على توفير الظروف المناسبة لامتصاص الأخر. وقد وجد (1998) .Avila et al أن الرقم الهيدروجيني لبيئة (Murashige & Skoog (1962); (MS ينخفض بمعدل 0.7 وحدة بعد 15 يوم من زراعة أفرع البطاطس إذا كانت البيئة تحتوي على الأمونيا كمصدر وحيد للنتروجين.

* لاحظ (1988) .Arnois et al احتواء النباتات النامية في بيئة بها الأمونيا كمصدر وحيد للنتروجين على نسبة مرتفعة وغير عادية من إنزيم (phosp.oenolpyruvate (PEP الضروري في عملية تثبيت ثاني أكسيد الكربون اثناء البناء الضوئي. لكن على الرغم من ذلك ثبط معدل تخليق الكلوروفيل والبناء الضوئي تحت هذه الظروف.

شكل 1: في اليسار الأفرع العادية لنباتات القرنفل Dianthus caryphylus النامية في مزارع الأنسجة وأفرع بها ظاهرة التميز الزجاجي في اليمين.

وسجلت الكثير من الدراسات أهمية النتروجين الكلى بالبيئة علاوة على صورته في عمليات نمو الخلايا وتكشفها وتحويل النتروجين إلى الصورة العضوية. فوفرة النتروجين في صورة ميسرة ضرورية للحصول على نمو معلق الخلايا في صورة غير متكشفة، بينما يؤدى انخفاض تركيز النتروجين إلى زيادة معدل أيض بعض المركبات الخالية منه مثل اللجنين المصاحب لعمليه التكشف. وبصورة عامة يمكن القول إن الأنسجة يمكنها النمو في بيئة تحتوي على الأمونيا فقط بإضافة محلول منظم للرقم الهيدروجيني لوسط النمو، حيث أن وفرة الأمونيا تزيد من معدل تكوين البروتين والأحماض الأمينية مع استهلاك أقل للطاقة من المواد الكربوهيدراتية. ويبدو أن هذا التغير في الأيض الطبيعي يسبب ظاهرة التميؤ الزجاجي. لكن يبدو أن الأمونيا لها دوراً في تنظيم عمليه انقسام الخلايا وتكون الجدر الخلوية بالإضافة إلى تأثيرها على نشاط منظمات النمو في المزرعة. ولوحظ تكشف أشطاء من كالوس نباتات Brassica عندما كان التركيز الكلى للنتروجين 35-45 مليمول وقل عدد الأشطاء بارتفاع أو انخفاض التركيز عن ذلك. كما سجل (1988) Gertsson زيادة في عدد الأشطاء المتكشفة من زراعة عنق أوراق نباتات Senecio hybridus بزيادة تركيز النتروجين في بيئة MS إلى 75 مليمول بينما انخفض العدد عند تركيز مليمول مع ثبات نسبة الأمونيا إلى النترات.

نسبة NH4⁺/NO3^- في البيئة

يعتبر أيون النترات مصدر هام للنتروجين في بيئات مزارع الأنسجة، وتحتوي أغلب البيئات على نسبة كبيرة من النتروجين في هذه الصورة والتي تعتبر غير سامة على العكس من الأمونيا التي تزيد من تخليق هرمون الإثيلين في أنسجة النبات فقد سجل (2006) Ogura-Tujita and Okubo انخفاضاً يقدر بـ 30-55% في معدل تخليق الإثيلين للمستأصلات النباتية لنبات Cymbidium kanran بعد 1 - 3 شهور من الزراعة عند استعمال بيئة MS فقيرة في النتروجين. وعند محاولة حساب التركيز الأمثل من الأمونيا والنترات في البيئة المستخدمة لزراعة أنسجة نبات ما لابد أن يؤخذ في الاعتبار التركيز الكلى للنتروجين بالإضافة إلى نسبة ^-3NH4⁺/ NO فمثلا بيئة MS تحتوى على نسبة عالية من أيون النترات مقارناً مع الأمونيا (34:66). كذلك يلاحظ أن التركيز الكلى للنتروجين بهذه البيئة أعلى من معظم البيئات الأخرى. وفي معظم البيئات المستعملة لزراعة البقوليات ينصح بزيادة هذه النسبة أي تركيز النترات إلى الأمونيا. وفى بعض المزارع يتم تعديل التركيز الكلي للنتروجين في البيئة المستعملة بغرض تحسن النمو. وقد أوضح (2008) George & Dekler أن لهذه النسبة أهمية في آلية فعل منظمات النمو لكن تظل هذه الآلية غير معروفة بصورة تامة. فعلى سبيل المثال تحتاج الخلايا إلى تركيز منخفض من السيتوكينين للانقسام عندما يكون تركيز النتروجين المختزل مرتفع نسبياً. ويحتاج بروتوبلاست خلايا الدخان إلى تركيز 0.5-2 ملجم/لتر من BA إذا كانت البيئة تحتوي النترات فقط. وعند إضافة الأمونيا أو حامض الجلوتامين للبيئة فإن التركيز الضروري من منظم النمو ينخفض، ويمكن للخلايا الانقسام بصور أسرع وبدون الحاجة إلى منظم النمو عند اضافة اليوريا والأمونيا أو الجلوتامين. كما تلعب صورة النتروجين دورا في استجابة الخلايا إلى تأثيرها على الرقم الهيدروجيني لجدر الخلايا. ويتضح ذلك للاكسينات وقد يرجع من جدول رقم (1) تأثير نسبة NH4⁺/ NO3^- وكذلك النتروجين الكلى على زراعة أنسجة نباتات Eucalyptus globulus كما أشار 2003 ,.Bennett et al) حيث يتضح أن استعمال ربع تركيز الأمونيا وبدون إضافة النترات وخفض تركيز الحديد إلى الربع في بيئة MS يعطى أفضل نسبة تجذير وعدد جذور بينما انخفضت النسبة المئوية لتكوين الجذور إلى النصف تقريباً برفع تركيز الأمونيا إلى نصف تركيزها.

وفي تجربة لدراسة تأثير صورة النتروجين المعدني في البيئة المستعملة لإكثار صنفين من نباتات Chrysanthemum تم تغيير تركيز النتروجين الكلى لبيئة MS والتي تحتوي على 60 مليمول نتروجين واستعملت تركيزات تتراوح بين 6- 240 مليمول مع المحافظة على ثبات نسبة الأمونيا والنترات كما هي في البيئة الأصلية. وأشارت النتائج إلى أن أعلى معدل لتكوين الأشطاء من الحامل الزهري المستخدم كجزء نباتي كان باستعمال تركيز 30 - 120 مليمول، وكان أقل معدل لتكوين الأشطاء عند استعمال تركيز 6 أو 240 مليمول اعتماداً على الصنف المنزع. ولوحظ انخفاض حاد في عدد الأشطاء المتكونة عند زيادة تركيز النتروجين عن 120 مليمول (1975) Rost & Bokelmann ولدراسة تأثير التركيز الكلى للنتروجين على الإكثار الدقيق وإنتاج المواد الفعالة لنباتات Ruta gravolens قام (2011), Mohamed and Ibrahim بخفض تركيز النتروجين من 90 مليمول في وسط MS إلى 60 مليمول أو رفعه إلى 120 مليمول مع المحافظة على نسبة الأمونيا للنترات ثابتة. وقد زاد الوزن الطازج للأشطاء برفع تركيز النتروجين حيث سجل 58، 68، و 69 جم/ دورق باستعمال تركيز 60 ، 90 ، و 120 مليمول من النتروجين على التوالي.

وعلى الرغم من عدم تأثر الوزن الجاف معنوياً باختلاف تركيز النتروجين فإن تركيز الروتين والفيروكيو مارين في المادة الجافة وكذلك الكمية الكلية قد زادت برفع تركيز النتروجين من 60 إلى 90 مليمول لكن قل المحصول النهائي عند تركيز 120 مليمول.

جدول 1: تأثير NH4⁺/NO3^- و FeNaEDTA في بيئة MS على إنتاج الجذور في مزارع أنسجة نباتات E. globulus كما أشار (2003) .Bennett et al.

وتوضح النتائج التي أشار إليها (2003) .Bennett et al أن تكوين الجذور على النباتات الناتجة من زراعة أنسجة نباتات E. globulus والمبينة في جدول رقم (2) أن هناك تأثيراً واضحاً لنسبة الأمونيا إلى النترات على تكوين الجذور. وكذلك كان لاختلاف مصدر النتروجين تأثيراً في عدد الجذور المتكونة للنبات الواحد. وبين (2006) .Woodword et al أن لمحتوى النسيج من النتروجين والذي يتأثر بالظروف البينية دوراً في استجابة المُستأصل النباتي في الزراعة المعملية وقد لاحظ أن أعلى معدل لتكوين الجذور على أفرع E. marginata تحقق عند احتواء بيئة MS على تركيز 7.5 مليمول من النتروجين وبنسبة 2:1 من النترات والأمونيا على التوالي، بالإضافة إلى 10 مليمول من (N-morpholino)ethanesulphonic acid (MES)-2 لتنظيم الرقم الهيدروجيني. وأمكن ثبات الرقم الهيدروجيني عند اضافة النتروجين في صورة نترات الفضة لكن باستعمال 10 مليمول من MES. ومن هذا يتضح ضرورة دراسة متطلبات كل نبات على حدى لمعرفة التركيز الأمثل من الأمونيا والنترات لنجاح تكوين الكالس وعمليات التكشف المختلفة.

ولدراسة تأثير تركيز الأمونيا والنترات على تكوين الأجنة الجسدية بزراعة السويقة الجنينية العليا لنباتات Pelargonium zonal رباعية التضاعف، تم تعديل تركيز نترات الأمونيوم في البيئة المستعملة من 94. إلى 11.4 مليمول. وكان لزيادة التركيز تأثير معنوي في عدد ونوعية الأجنة المتكونة. حيث زاد عدد الأجنة ذات الطور الكروي globular ليتراوح بين 2 إلى 3 جنين/ مستأصل نباتي، وهي تمثل زيادة مقدارها 27 % عن البيئة الخالية من نترات الأمونيوم. وبينما أدى التركيز العالي 6.6- 11.4 مليمول لزيادة عدد الأجنة في الطور السابق انخفض كما عدد الأجنة التي تطورت إلى الطور القلبي التوربيدي heart torpedo وفشلت الأجنة المتكونة في تكوين الأوراق الفلقية. وكان أحسن معدل لتكوين الأوراق الفلقية هو استعمال تركيز 2.4 مليمول من نترات الأمونيوم (1996 ,.Wilson et al).

2 . الفوسفور

يزيد تركيز الفوسفور في القمم الميرستيمية للنبات ويتشابه دوره مع النتروجين من حيث مدى أهميته للنبات بالرغم من احتواء الأنسجة على كميه قليلة منه مقارنة بالنتروجين ويدخل الفوسفور في عمليات البناء الضوئي وتكوين وانقسام الخلايا وكذلك تطور الجذور، كما أن للفوسفور دوراً أساسياً في تخليق المركبات الناقلة للطاقة. ويتم امتصاص الفوسفور امتصاصاً نشطاً من وسط النمو وتستعمل في الصورة الثلاثية المؤكسدة PO^3-4 . ويضاف الفوسفور إلى بيئة مزارع الأنسجة في صورة

جدول 2: تأثير استعمال مصادر مختلفة للنتروجين على التجذير نباتات E. globulus كما بينها (2003) .Bennett et al.

فوسفات الصوديوم أو البوتاسيوم أحادية أو ثنائية الهيدروجين. ويتم تحول الفوسفور بين الصورة الأحادية والثنائية التكافؤ لهذه الأملاح في البيئة اعتمادا على الرقم الهيدروجيني. فعندما يكون الرقم الهيدروجيني اقل من 7 تكون الصورة الأحادية H₂PO^-₄ هي السائدة والممتصة، وبزيادة قلوية الوسط تتحول هذه الصورة إلى الصورة الثنائية HPO^2-₄ الأقل امتصاصاً. لكن يعتقد أن الصورة الثنائية لها قابلية للارتباط بمواقع الامتصاص على سطح الخلايا بدرجة أعلى من الأحادية مما يزيد من امتصاصها. أما الصورة الثلاثية PO^3-₄ الموجود في الوسط القلوي فهي غير ممتصة، لكنها قد تصبح ميسرة للامتصاص عن طريق إنزيمات الفوسفاتيز التي تفرز من الأنسجة (1993 ,George).

تحتوي معظم البيئات على تركيز 1.3 - 1.7 مليمول من الفوسفور والذي يضاف غالباً في صورة فوسفات البوتاسيوم وفوسفات الصوديوم المائية KH2PO4 + NaH2PO4.2H2O. وقد لاحظ (1995 .Leifert et al) أنه بالرغم من عدم كفاية محتوى بيئة MS من الفوسفور لنمو مزارع أنسجة نباتات Hemerocallis و Iris و Delphinium كان للمزرعة القدرة على النمو لبعض الوقت بعد استنفاذ الفوسفور من الوسط. ومن ثم ينصح برفع تركيز الفسفور في هذه البيئة إلى 3.71 مليمول لزيادة معدل تكوين الأشطاء. وقد يسبب الاستهلاك المبكر للفوسفات من البيئة في المراحل الأولى من النمو تغيير رقمها الهيدروجيني. لكن يجب ملاحظة أن زيادة الصورة الميسرة من الفوسفات ربما تؤدى إلى تثبيط النمو في مزارع الأنسجة نظرا لترسيب الكالسيوم وبعض العناصر الأخرى.

وقد أدى نزع الفوسفات كليا من بيئة MS زيادة تركيز الأحماض الأمينية الحرة في معلق خلايا الدخان وتوقف تخليق البروتين وزاد معدل تكسيره. ومن البديهي أن يتوقف معدل امتصاص الفوسفور على النوع النباتي ومعدل النمو، ففي معلق خلايا نباتات Catharanthus roseus المنزرع في بيئة MS المعدلة لتحتوي على تركيزات متباينة من الفوسفور زادت مدة النمو بزيادة تركيز الفوسفات إلى 2.64 مليمول. كما وجد أن تركيز 2.51 مليمول من الفوسفات غير كافي لبعض النباتات وتزيد سرعة النمو والتكشف بزيادة الفوسفات إلى أن يصل إلى الحد الأمثل لكل نبات. ويعتبر تركيز الفوسفور في بيئة MS غير كافيا لبعض النباتات إذا كان معدل النمو عالياً مع استعمال كمية قليلة من البيئة، حيث ينخفض تركيز الفوسفات بسرعة. وقد سجل .Leifert et al (1995) انخفاض في تركيز الفوسفات إلى حد لا يكفى نمو المزارع التي سبق الإشارة إليها بعد عدة أسابيع من الزراعة وبالرغم من ذلك يمكن أن يستمر النمو لبعض الوقت حيث يمتاز الفوسفات بأنه عنصر متحرك ينتقل من الأنسجة المسنة إلى الحديثة. ولتحسين معدل التكشف عدة أصناف من العنب قام (2000) .Mharea et al برفع تركيز الفوسفات في وسط MS إلى 218 ملجم/لتر من فوسفات الصوديوم الأحادية. كما كان لمضاعفة تركيز أملاح MS تأثير مشجع على إكثار نباتات Prunus avium وتوقف ذلك على تركيز ومعدل امتصاص كلا من النتروجين والفوسفورRuzic et al 2000  وقد امكن التغلب على ظاهرة التميز الزجاجي مع زيادة عالية جدا في معدل تكوين الأشطاء تصل إلى ثلاث أضعاف (34 فرع / مُستأصل) برفع تركيز الفوسفات في بيئة MS إلى 37.5 (شكل رقم 2). وإذا كان لزيادة تركيز الفوسفات تأثيراً ايجابيا للنمو في مزارع أنسجة النبات المستهدف فينصح بدراسة التأثير المشجع الميوانسيتول (2011 Mohamed,). وقد تبين في هذه الدراسة الزيادة المعنوية العالية في الوزن الطازج والجاف وكذلك النسبة بين الوزن الطاج والجاف للأشطاء التي نمت في الوسط ذو التركيز العالي من الفوسفات.

3. البوتاسيوم

وهو من العناصر الأساسية ذات التركيز المرتفع في الأنسجة النباتية، وقد تفوق الكمية الممتصة منه باقي العناصر الأساسية عدا النتروجين على الرغم من عدم اشتراكه في تخليق المركبات العضوية داخل النبات. وللبوتاسيوم دور مهم من حيث انقسام الخلايا وتكوين الكربوهيدرات والبروتين وبعض الإنزيمات والكلوروفيل، وكذلك في معادلة الشحنات السالبة للأيونات العضوية وغير العضوية. ويمر البوتاسيوم بعد امتصاصه بسرعة عبر الغشاء الخلوي ليلعب دوراً أساسياً في تنظيم الرقم الهيدروجيني والضغط الاسموزي للخلايا لأن أيونات البوتاسيوم، والكالسيوم والكلور تحتفظ بشحنتها داخل النبات على العكس من H2PO4^- ، SO4^2- ، 4NH⁺ التي تشارك في تكوين المركبات العضوية بسرعة. ويؤدى نقص البوتاسيوم إلى نقص ضغط الامتلاء للخلايا وبذلك تصبح الأنسجة رخوة وحساسة للإجهاد المائي والملوحة. يتحرك أيون البوتاسيوم في النبات مصاحباً لأيون النترات في الخشب وعند اختزال النترات إلى امونيا تتكون أحماض عضوية R-CO3 ويصاحبها أيون البوتاسيوم في اللحاء حتى الجذر حيث يتم نزع مجموعة الكربوكسيل ومعادلتها بالهيدروكسيل. ثم يرتبط أيون البوتاسيوم بأيون نترات جديد ويتحرر أيون الهيدروكسيل لمعادلة ايون النترات الممتص وبذلك يحافظ على الرقم الهيدروجيني للوسط. ويلعب البوتاسيوم نفس الدور في مزارع الأنسجة لكن تظل ميكانيكية النقل غير واضحة بصورة تامة. ويؤدي نقص البوتاسيوم في البيئة إلى ظاهرة التميز الزجاجي ونقص امتصاص الفوسفات. ويلاحظ من جدول رقم (3) أن البوتاسيوم هو الأيون السائد في معظم البيئات بعد أيون النتروجين (Dixon & Gonzade1994).

شكل 2: ظاهرة التميز الزجاجي في مزارع أشطاء القرنفل Dianthus caryphyllus في الوسط وفى اليمين يلاحظ اختلاط النمو بين الطبيعي والمتمئ في بيئة MS، أما في اليسار فيلاحظ النمو الطبيعي مع زيادة في التكشف برفع تركيز الفوسفات في بيئة MS إلى 6.45 مليمول.

لكن أشار (1988 Loretical et al.,) إلى عدم تأثير رفع تركيز البوتاسيوم في بيئة MS على نمو مزارع Prunus persica . وغالباً يضاف البوتاسيوم للبيئة في صورة نترات البوتاسيوم وفوسفات البوتاسيوم KNO₃ و ₄KH₂PO وأحيانا كلوريد البوتاسيوم.

4. الماغنسيوم

يدخل الماغنسيوم في تكوين جزئ الكلوروفيل بنسبة 15-20 %، وكذلك يساهم في تنشيط عديد من الإنزيمات خاصة تلك المنوط بها انتقال الفوسفات وحركة السكريات داخل النبات وتمثيل الأحماض النووية. وبجانب هذا الدور المغذى يلعب الماغنسيوم دوراً في الاتزان الأيوني في النبات. وتحتوي بيئات مزارع الأنسجة على تركيز منخفض نسبياً من الماغنسيوم يتراوح بين 0.751-1.623 مليمول، ويضاف غالباً في صورة كبريتات الماغنسيوم المائية MgSO4.7H2O. وبانخفاض تركيز الماغنسيوم في البيئة المستخدمة لإنتاج الأجنة الجسدية في كالوس نباتات Medicago sativa قل عدد الأجنة المتكشفة. وسجل (2004) .Kintzios et al ارتفاع في محتوى مزارع الأجنة الجسدية لنباتات البطيخ من الماغنسيوم بالمقارنة مع مزارع الكالس، مما يشير إلى دوره في تكشف الأجنة الجسدية. ولاحظ (1999) Ohki & Sawakit أن الأشطاء المتكشفة من زراعة مستأصلات من الحامل النوري لنبات Delphinium cardinale في بيئة MS ضعيفة النمو شاحبة اللون بسبب انخفاض تركيز الماغنسيوم أو الحديد. ومن ثم تم رفع تركيز كلاهما مع ثبات تركيز الأمونيا والنترات أو خفض تركيز الأمونيا ورفع تركيز النترات للمحافظة على نفس التركيز الكلى للنتروجين المعدني وهو 60 مليمول. وتوضح النتائج المبينة في جدول رقم (4) تأثير الماغنسيوم، والحديد على عدد الأشطاء المتكونة ووزنها وكمية الكلوروفيل في أوراق النباتات المتكشفة.

5. الكبريت

ينتشر الكبريت بانتظام بين أعضاء وأنسجة النباتات المختلفة فهو أحد مكونات بعض الأحماض الأمينية مثل السستين والسستئين والتي تدخل في تكوين البروتين وبعض الفيتامينات كالثيامين. والجزء الأكبر من الكبريت يوجد في الكلوروبلاست.

6. الكالسيوم

يعتبر أيون الكالسيوم Ca²⁺ أحد الكاتيونات السائدة في النبات خصوصا بالعصير الخلوي ويتم تثبيت معظم الكالسيوم الممتص في جدر الخلايا في صورة بكتات الكالسيوم التي تكون الصفيحة الوسطى الضرورية في انقسام الخلايا. كما يساعد الكالسيوم أيضاً في حركة الكربوهيدرات والأحماض الأمينية خلال النبات. وللكالسيوم دوراً في التخلص من بعض نواتج الأيض حيث يتحد مع بعض المركبات السامة كحامض الاكسالك ليكون اكسلات الكالسيوم. ويعتمد تكوين إنزيم glucan (1,3)-ꞵ الهام في أيض السيليلوز على وجود الكالسيوم، لذا فإن تكوين السيليلوز في خلايا مزارع الأنسجة لا يتم إلا في وجود الكالسيوم في البيئة. كذلك فإن نشاط بعض الإنزيمات والتفاعلات الفسيولوجية التي تحدثها الأوكسينات والسيتوكينينات لا يتم في غياب الكالسيوم من الوسط. وعلى الرغم من أن الكالسيوم يوجد في السيتوبلازم بتركيز واحد مليمول فإن النبات يقوم بضخه الكالسيوم إلى الفجوات العصارية ليحافظ على تركيز 0.1 ميكرومول لتفادى ترسيب الفوسفات في السيتوبلازم وكذلك إعاقة عمل أيون الماغنسيوم.

للكالسيوم دور هام في تكشف الأعضاء في مزارع الأنسجة من خلال تأثيره على الفعل الحيوي لمنظمات النمو حيث يزيد السيتوكينين من ارتباط الكالسيوم بالجدر الخلوية في المناطق التي تتكشف منها البراعم العرضية لاحقا. وقد لاحظ Capitiani (2004) and Altamura أن إضافة الكالسيوم تشجع تكوين المناطق الميرستيمية التي تعتبر الطور الأول لتكوين الأشطاء عند زراعة نخاع الدخان. ولأن الكالسيوم غير متحرك داخل الأنسجة النباتية فإن الأفرع حديثة التكشف تحتاج إلى تركيز ثابت منه في العصارة المتدفقة. وتتضح أعراض نقص الكالسيوم في المزرعة بعد عدد مرات تكرار الاستزراع على هيئة اصفرار ويتبع ذلك موت القمم النامية وتكوين مزيد من الأفرع الجانبية وغالباً يصاحب ذلك ظاهرة التميز الزجاجي. وكان لزيادة تركيز الكالسيوم في بيئة MS بإضافة 2.5 مليمول باستعمال كلوريد الكالسيوم مع إضافة 200 مليمول من البورن دورا فعالا في التغلب على مشكلة موت القمم النامية لنباتات Haloxylon persicum كما أشار (2012 ,.Mohamed et al) .

وحيث أن أعراض نقص الكالسيوم قد تعزى إلى بطء امتصاصه أو انتقاله بسبب ارتفاع الرطوبة النسبية في الفراغ الغازي للمزرعة Roche & Cassells (1996) فإن العمل على خفض الرطوبة النسبية في جو المزرعة وبالتالي زيادة معدل النتح باستعمال ظروف بيئة خاصة يقلل من أعراض نقص الكالسيوم في نباتات Helianthus tuberosus. لكن أشار (2013 .Mohamed et al) إلى عدم فاعلية زيادة معدل تهوية أوعية الزراعة بهدف خفض المحتوى الرطوبي في التخلص من مشكلة موت القمم النامية. وقد يستعمل تركيز أعلى من الكالسيوم لنفس الغرض، لكن يتوقف التركيز الأمثل على التركيب الوراثي للنبات ففي بعض الحالات لم يكن لإضافة المزيد من الكالسيوم تأثيراً في النمو أضف إلى ذلك أن المزيد من الكالسيوم في صورة كلوريد قد يسبب ظهور أعراض التسمم بالكلوريد ويضاف الكالسيوم إلى بيئات زراعة الأنسجة في صورة كلوريد الكالسيوم المائي CaCl2.2H2O أو نترات الكالسيوم المائية Ca(NO3)2.4H2O.

جدول 3: تركيز ايونات العناصر الكبرى في البيئات شائعة الاستعمال (Dixon & Gonzade1994).

جدول 4: تأثير تغير تركيز الأمونيا والماغنسيوم والحديد في بيئة MS على الإكثار الدقيق لنبات D. cardinale كما أوضحها (1999) Ohki & Sawaki.

ب. العناصر المغذية الصغرى Microelements

وهي لا تقل في أهميتها عن العناصر الكبرى لكن تحتاجها النباتات بتركيزات منخفضة مقارنة مع تلك الكبرى. وقد اتضح مدى أهمية العناصر المغذية الصغرى للنبات خلال النصف الأخير من القرن الماضي. وتضم هذه المجموعة الحديد، النحاس، المنجنيز، الزنك، الكوبلت النيكل، اليود المولبدنيم وترجع فاعلية تلك العناصر لقدرتها على تغيير تكافؤها داخل النبات مما يزيد من نشاط الإنزيمات الضرورية للكثير من العمليات الحيوية وللعناصر الصغرى أهمية في نشاط بعض الهرمونات وعمل الجهاز الوراثي للخلية. وفى بداية تطوير علم زراعة الأنسجة لم تضاف تلك العناصر للبيئة، وعلى الرغم من ذلك لم تظهر أعراض نقصها على الأنسجة. ويرجع ذلك لعدم نقاوة الكيماويات المستخدمة آنذاك والتي كانت تعتبر مصدراً لتلك العناصر.

وربما تحتاج بعض المزارع إلى تركيز أعلى من العناصر الصغرى عن الكميات المستعملة في معظم البيئات مثل MS، فعلى سبيل المثال تطلب تكشف الأشطاء من كالوسات 54 طرز وراثي لنباتات Glycine max اضافة أربعة أمثال تركيز العناصر الصغرى للبيئة المشار إليها (1986 .Barwale et al). ويشير .Gislerod et al (2005) إلى أن زيادة تركيز عناصر Fe و Mn و B و Cu و Zn و Mo في بيئة MS المستخدمة لإكثار أغلب نباتات الزينة سوف يشجع تكوين نباتات ذات جودة عالية. ووجد (2005) Bouman &Tekstra أن مضاعفة تركيز النحاس 16 ضعف تركيزه في بيئة MS كان له تأثير ايجابي كبير في نمو العديد من المزارع . وعلى الرغم من ذلك أدى خفض تركيز العناصر الصغرى عدا الحديد في بيئة MS إلى ظاهرة التميؤ الزجاجي في القرنفل لكن لم يكن لذلك جدوى في نباتات Gerbera.

وعموماً تزداد حاجة الخلايا لتلك العناصر خلال مرحلة التكشف فقد يتكون الكالس دون تكشف إلا في وجود تلك العناصر. ولعل من المفيد أن نستعرض الدراسة التالية عن تأثير تعديل تركيز العناصر المعدنية في بيئة النمو والمعتمد على تحليل أنسجة نبات Saintpaulia iomantha على استجابتها في مزارع الأنسجة وكذلك بعد نقلها إلى الصوبة (2005 ,.Gislerod et al). فقد تم إكثار النباتات في البيئات الثلاثة المبينة في جدول رقم (5). وكررت التجربة 6 مرات ووضحت النتائج وجود اختلافات كبيرة بين البيئات الثلاثة من حيث معدل النمو في المعمل والبقاء بعد الأقلمة وتعدى الأمر ذلك إلى حجم النبات وبدء التزهير في الصوبة. وكانت البيئة المعدلة RS 1997-3 افضل الثلاث بيئات المختبرة وبدءت النباتات في التزهير بعد 71 يوم فقط في حين ازهرت النباتات التي تم إكثارها في بيئة MS المعدلة بعد 104 يوم (جدول رقم 6) وبالطبع فإن لميعاد الإزهار وحجم النبات أهمية كبيرة في التسويق التجاري لهذه النباتات بالإضافة إلى خفض فترة بقائها في الصوبة. لكن يجب الحذر فقد تسبب زيادة تركيز العناصر الصغرى عن الحد الأمثل ظهور أعراض السمية على الأنسجة.

1. الزنك

وهو يوجد في جميع أجزاء النبات لأنه عامل أساسي في نشاط العديد من الإنزيمات المسئولة عن تكوين الكلوروفيل. كما يرتبط إنتاج هرمون اندول حامض الخليك IAA بتوفير الزنك لأنه يدخل في تخليق الإنزيمات الفعالة في تصنيع حامض التربتوفان، والذي يعتبر بادئ لتخليق IAA. ومن ثم فإن النباتات التي تتضح عليها أعراض نقص الزنك تعاني من نقص تخليق البروتين والأحماض النووية والكلوروفيل. ويضاف الزنك لبينة مزارع الأنسجة بتركيز ما بين 0.1 - 70 ميكرومول في صورة سلفات الزنك المائية ZnSO4.7H2O. وقد لاحظ (1997) .Hossain et al زيادة معدل نمو معلق خلايا الأرز بسبب نشاط IAA عند رفع تركيز الزنك في بيئة النمو إلى 520 ميكرومول. وفي مزارع أشطاء Eucalyptus كان للزنك أهمية في تكشف الجذور العرضية لكن قد تسبب الزيادة الكبيرة منه تثبيط نمو الجذور (2005Schwambach et al) ولعل التباين الكبير في تأثير تركيز الزنك على نمو الجذور راجعاً إلى اختلاف حساسيتها لتأثير IAA.

3. المنجنيز

يعتبر المنجنيز واحدا من أهم العناصر الصغرى إذ يلعب دوراً في تكوين أغشيه الكلوروبلاست لذا تتضح أعراض نقصه في اصفرار الأوراق. كما يثبط نقص المنجنيز نشاط الكثير من الإنزيمات مثل الديهدروجنيز والديكربوكسيلز ويتشابه نشاط أيون المنجنيز كثيراً مع الماغنسيوم ويمكن أن يحل محله في تنشيط بعض الإنزيمات لكن تركيز الماغنسيوم في خلايا النبات أعلى بمعدل 50 - 100 مرة من المنجنيز. وقد يستهلك النبات المزيد من أيون المنجنيز بانخفاض المولبيدنيوم والعكس صحيح. ويؤثر وجود أيون المنجنيز على عمليات التكشف حيث أدى خلو البيئة المستخدمة في زراعة الأوراق الفلقية للخس إلى انخفاض عدد البراعم المتكونة. وقد يفسر ذلك بأن زيادة تركيز أيون المنجنيز تنشط الإنزيمات المؤكسدة لاندول حامض الخليك IAA وبالتالي انخفاض تركيز IAA بينما لا تتأثر الأوكسينات المصنعة بذلك. وتحتوى معظم البيئات على تركيز 25 - 150 ميكرومول من تركيز أيون المنجنيز والذي يضاف في صورة كبريتات المنجنيز المائية MS720 .

3. البورون

يقوم البورون بتنشيط العديد من الإنزيمات وانقسام الخلايا والعمل على زيادة مسامية الجدر وانتقال الكربوهيدرات، وبالتالي يحدث تراكم للنشا في حالة نقص البورون. كما أن للبورون أهمية في أيض المركبات الفينولية لدوره كعامل مساعد للإنزيمات المسئولة عن أيض حامض P-coumoric، ويدخل البورون في تكوين الحامض النووي الريبوزي RNA والقواعد النيتروجينية اللازمة لانقسام الخلايا وتكوين القمم النامية.

جدول 5: تركيب ثلاث بيئات استخدمت لاكثار نباتات S. ionantha كما وجدها Gislerod et al. 2005

ويعتقد أن للبورون دور في ثبات المركبات المخلبية الطبيعية اللازمة لبناء الجدر والأغشية الخلوية ونشاطها الفسيولوجي. لكن يزيد تخليق الكامبيوم ونمو البراعم الجانبية مما يعطى النبات الشكل المتورد بنقص البورن في بيئة النمو.

جدول 6: تأثير تركيب ثلاث بيئات استخدمت لإكثار نباتات Sionantha على نموها في المعمل وبعد النقل للصوبة (2005 ,.Gislerod et al).

يمتص النبات البورون والذي يصل تركيزه في أغلب البيئات إلى 50-100 ميكرومول في صورة حامض البوريك H3BO3 وتؤدى زيادة تركيز البورون عن ذلك إلى ظهور أعراض السمية على الأنسجة المنزرعة. أما في حالة إنبات حبوب اللقاح معمليا وحالات نادرة من مزارع الأشطاء والكالس فإن البورون يضاف بتركيز يصل إلى 646 ميكرومول. وباستعمال تركيز 200 مليمول من البورن مع 2.5 مليمول كالسيوم تمكن (2013 ,.Mohamed et al) من التغلب على مشكلة موت القمم النامية لنباتات Haloxylon persicum. وقد يلعب البورون دوراً مساعداً للأوكسينات في تكشف الجذور (2005 ,.Schwambach et al) لكن لم يلاحظ تأثيراً للبورون في تكشف الجذور على العقل الدقيقة لنباتات Eucalyptus. وفى حالة إضافة السكريات الكحولية مثل المانيتول فإن البورون يتحد معها ليكون معقد وتظهر أعراض نقصه بعد فترة لذا يجب استبدال السكريات الكحولية بالسكر بعد فترة من الزراعة لتفادى ذلك.

4. النحاس

تحتوي النباتات عموماً على تركيز منخفض جدا من النحاس الذي يوجد في صورة أحادية أو ثنائية التكافؤ حيث يتم أكسدة الصورة الأحادية إلى الثنائية أو اختزال الثنائية إلى أحادية بسهولة داخل الأنسجة ويرتبط النحاس بعديد من الإنزيمات خصوصاً إنزيمات السيتوكروم مثل السيتوكروم أكسيديز المسئول عن الأكسدة أثناء التنفس وكذلك إنزيمات أكسدة مركبات الفينول كحامض الأبسيسك ABA، والذي يعتبر من مثبطات النمو الطبيعية. وتؤدى أكسدة المركبات أحادية الفينول بالإنزيمات المحتوية على أيون النحاس إلى تكوين الصبغات البنية والسوداء اللون في بعض مزارع الأنسجة وهي ظاهرة غير مرغوبة حيث تعتبر هذه المواد ساسة للأنسجة وتعيق النمو والتكشف. ويؤدى نقص النحاس من مزارع الأنسجة إلى تقزم وتشوه النمو تحتوي بيئة زراعة الأنسجة على تركيز يتراوح بين 0.1 - 100 ميكرومول من النحاس والذي يضاف في صورة كبريتات النحاس المائية CuSO4.5H20. وقد لوحظ ان نقص النترات يسبب انخفاض معدل امتصاص النحاس وبالنظر إلى محتوى النباتات من النحاس يلاحظ الانخفاض الشديد في مكونات البيئات المختلفة منه. وعلى هذا لاحظ البعض أن زيادة تركيز النحاس إلى خمس أضعاف التركيز الشائع قد تشجع من النمو (2005 ,Bounan & Tiekstra). لكن قد تسبب التركيزات العالية أعراض السمية على المزرعة، وقد شاهد (2003) .Kumar et al انخفاض معدل نمو أشطاء نباتات Tinospora chordifolia عند زيادة تركيز النحاس إلى 125 مليمول.

5. المولبيدنيوم

يوجد المولبيدنيوم بكمية قليلة في أنسجة النبات على الرغم من دوره المهم في تمثيل النتروجين واختزال النترات حيث يعمل كعامل مساعد لإنزيم النتروجينيز والنترات ريدكتيز وتثبيت النتروجين في النباتات البقولية. ويمتص النبات المولبيدنيوم في صورة أيون MoO4^2- والذي يضاف إلى مزارع الأنسجة في صورة مولبيدات الصوديوم المائية NaMo4.2H20 بتركيز يصل إلى مليمول واحد، والتركيزات المرتفعة نسبياً والتي تصل إلى 10 ميكرومول تكون سامه. أما عند نقص المولبيدنيوم في البيئة تظهر أعراض التسمم بالنترات على الأنسجة لعدم اختزالها إلى أمونيا.

6. الكوبلت

يدخل الكوبلت في تكوين معقد فيتامين B12 الهام في تثبيت النتروجين. وعلى الرغم أن الكوبلت لا يصنف ضمن العناصر الأساسية فإن أغلب البيئات التي تستعمل في مزارع الأنسجة تحتوي على تركيز حوالي 0.1 - 1 ميكرومول منه حيث يعتقد أن له دور في تنظيم عملية التكشف. لكن من الصعب الحصول على تأكيد لدور الكوبلت في تكوين الأحماض الأمينية في مزارع الأنسجة (2008 George & De-kler). وقد ترجع أهميته في مزارع الأنسجة إلى تثبيط بعض عمليات الأكسدة التي تتم بوجود الكوبلت أو الحديد وكذلك تثبيط إنتاج غاز الإثيلين. ويضاف الكوبلت في صورة كلوريد الكوبلت المائي CoCl₂.6H₂0 بتركيز حوالي 0.0250 ملجم/ لتر.

7. اليود

ليس من المعتاد اعتبار اليود عنصراً أساسياً لنمو النبات رغم وجوده في بعض الأحماض الأمينية ودوره في نمو الجذور ربما لنشاطه كعامل مختزل. وقد أدت زيادة تركيز اليود من 5.0 - 0.001 ميكرومول إلى منع اسوداد مزرعة نخيل جوز الهند وتحسين نمو الكالس. وعلى ذلك أضيف اليود إلى حوالي 65% من البيئات التي استخدمت في مزارع الأنسجة في صورة يوديد البوتاسيوم أو أي صورة أخرى مثل Iodeacetate حيث يتحرر منها اليود بالتحلل المائي. لكن لم يسجل تأثير سلبي على نمو الكثير من مزارع الأنسجة باستعمال بيئة خالية منه.

8. النيكل

لم يكن هناك إدراك لأهمية النيكل والألومنيوم لمزارع الأنسجة عند تحديد تركيب معظم البيئات التي استعملت في مزارع الأنسجة لكن أشار .Gerendas et al (1999) إلى ضرورة النيكل للنمو لأنه يدخل في نشاط إنزيم اليوريز الذي يحول اليوريا إلى الأمونيا وبالتالي يحسن من نمو أشطاء البطاطس (2002 ,.Witte et al). كذلك لوحظ تحسن في النمو واستجابة الأنسجة المنزرعة من النباتات البقولية عند إضافة النيكل لمزارع أنسجة البقوليات ولا يضاف النيكل مباشرة إلى مزارع الأنسجة إلا أنه يوجد كشوائب في الأجار المستعمل لتصلب البيئة.

9. الكلوريد

يلعب الكلوريد وهو من الأيونات المتحركة في النبات دوراً في تنشيط بعض العمليات الفسيولوجية مثل المحافظة على ضغط الامتلاء والاتزان الأيوني كذلك البناء الضوئي، لكن آلية هذا التنشيط غير معروفه على وجه الدقة. وتحتاج النباتات إلى كميات قليلة جدا من الكلوريد لكنها قد تتحمل تركيزات عالية نسبياً دون ظهور أعراض التسمم. والتركيز الشائع استخدامه في مزارع الأنسجة من الكلوريد هو 3 ميكرومول وقد يصل إلى 6 ميكرومول في حالة زراعة الأعضاء المتكشفة. وتؤدى التركيزات العالية منه خصوصا في أنسجة الأشجار المنزرعة معمليا إلى اصفرار الأوراق وضعف السوق وظاهرة التميز الزجاجي والتي تزول بخفض تركيزه. وقد حاول البعض إزالة الكلوريد من البيئة ولكي يتم ضبط الاتزان الأيوني استعملت SO4^2- بتركيز أعلى حيث زادت كمية سلفات الأمونيوم بدلاً من كلوريد الأمونيوم وبذلك زاد تركيز السلفات من 16:1 ميكرومول لكن سبب ذلك تأثير غير مرغوب.

10. الحديد

للحديد قدرة عالية على التأكسد والاختزال داخل النبات، وبذلك له تأثيرات فسيولوجية مهمة فيدخل في نشاط عديد من الإنزيمات خصوصاً النشطة في عمليات التنفس. وعلى الرغم من عدم اشتراك الحديد في تركيب الكلوروفيل إلا أنه مهم في تكوينه والحفاظ عليه، حيث يشترك الحديد في تكوين بروتينات الحديد ferredoxin protein وهي الناقلة للإلكترونات في عملية البناء الضوئي وكان الحديد في بداية استعماله في بيئات زراعة الأنسجة وقبل استخدام المركبات المخلبية يضاف في صورة Fe²⁺ أو Fe³⁺ باستعمال سلفات الحديدوز أو طرطرات الحديديك. ورغم الخصائص المخلبية لحامض الستريك والطرطريك فلم يحققا حفظ الحديد في صورة ميسرة للأنسجة في البيئة. حيث لا ينفرد الحديد مرة أخرى بعد ارتباطه بهما إلا إذا تم خفض الرقم الهيدروجيني وهو الأمر غير المتاح في المزرعة خصوصا في الظروف الهوائية. وباكتشاف واستخدام المركبات المخلبية في مزارع الأنسجة في الخمسينيات لوحظ تحسن في النمو وتكوين الأفرع في بيئات عديدة كان من غير الممكن استعمالها للتكشف. ولهذا أصبح الحديد لا يضاف إلا في الصورة المخلبية المعروفة ومنها EDTA و EGTA و EDDAH و DTPA . وعلى الرغم أن الحديد يتم امتصاصه في الصورة الحرة كمركب غير معقد من المركبات المخلبية إلا أن هناك تأكيدات أن المركبات المخلبية نفسها تمتص بواسطة الأنسجة المنزرعة.

وعند التركيزات المنخفضة وجد تأثير متشابه لمركب EDTA مع الأوكسينات وقد فسر ذلك بارتباط العامل المخلبي مع الكالسيوم في الجدار الخلوي، أو أن نشاط IAA كاوكسين يرجع لقدرته على الارتباط ببعض الأيونات وبذلك يتشابه مع المركبات المخلبية. ومعقد Fe(III)-EDTA ثابت عند الرقم الهيدروجيني 2-3 لكن بارتفاع الرقم الهيدروجيني عن ذلك كما هو الحال في بيئات زراعة (الأنسجة) يتحرر بعض الحديد ويترسب في صورة معقد مع الفوسفات، ويرتبط المركب المخلبي مع بعض الأيونات الأخرى فتصبح غير ميسرة. وقد توصل (1987) Teasdale إلى أن كل النحاس وأغلب الزنك تقريباً وبعض المنجنيز المضاف إلى البيئة يصبح مرتبطا بالمركب المخلبي. ولم يكن من الواضح عدم تيسر تلك العناصر في هذ الحالة إلا أن عدم ظهور أعراض النقص على المزرعة يشير إلى إمكانية امتصاصهما. لكن من الضروري الإشارة إلى عدم أضافة أكثر من 0.1 مليمول من EDTA لتجنب أعراض سميتها على بعض النباتات. وقد لاحظ (1999) Ohki & Sawaki زيادة معنوية في كمية الكلوروفيل الكلى (أ + ب) في أوراق الأشطاء المتكشفة من زراعة أجزاء من الحامل النوري لنبات Delphinium cardinale عند رفع تركيز الحديد في بيئة MS إلى الضعف خفض تركيز الأمونيا وزيادة النترات وذلك للمحافظة على التركيز الكلى مع للنتروجين المعدني عند 60 ميكرومول. ويوضح جدول رقم (7) تأثير تركيز الحديد والأمونيا على كمية الكلوروفيل في الأوراق.

وللفحم النباتي المستعمل في مزارع الأنسجة قدرة متباينة على امتصاص بعض المركبات المخلبية المختلفة، لذا أشار (2003) .Dimassi et al و (2006) Orlikowska & Zawadzka أن استخدام FDDHA افضل من FeEDTA. كذلك زرع (1994) .Salm et al العقد الساقية لصنف الورد Moneyway الذي يستعمل كأصل للتطعيم في بيئات MS و (Quoirin and Lepoivre (QL و WP مع استعمال EDTA أو EDDHA في بيئتي MS و QL كمصدر للحديد. وقد وجد أن EDDHA يساهم في التغلب على الاصفرار وانخفاض محتوى الكلوروفيل مع زيادة في طول الأشطاء بالرغم من عدم تأثر الرقم الهيدروجيني حتى بعد 6 أسابيع من الزراعة. ويرجع (2005) .Gislerod et al ذلك إلى حساسية EDTA للضوء فربما تسبب زيادة شدة الإضاءة إلى ظهور أعراض نقص الحديد عند استعمال EDTA بدلا من EDDHA.

جدول 7: تأثير تركيز الأمونيا والحديد في بيئة MS على تركيز الكلوروفيل في أوراق نبيتات Delphinium cardinale الناتجة من الإكثار الدقيق (Sawaki  & Ohki, 1999)

تشجع EDTA نمو جذور النباتات الناتجة في زراعة الأنسجة في الظلام وتفقد الجرعات المنخفضة من EDTA هذا النشاط بإضافة تركيز أيون الحديديك. وفسر ذلك بأن أيون الحديديك يرتبط مع EDTA ليحرر كاتيونا آخر كان مرتبطاً بها يسبب تثبيط تكوين الجذور. وكما أن التركيزات العالية من EDTA تسبب سمية للنباتات النامية في المحاليل المغذية فإنها تسبب سميه أيضاً في مزارع الأنسجة وتقلل من عدد الأشطاء المتكشفة، وقد تثبط تكوين الأشطاء تماماً وفسر ذلك بأن أيون الحديديك المنفرد من EDTA يسبب ترسيب الفوسفات واصفرار الأوراق والذي يزول بإضافة 6.4 مليمول من H₂PO₄.