العوامل المؤثرة على النمو والتكشف في مزارع الأنسجة (العوامل المتعلقة بالنبات الأم)

تتعدد صور تأثير النبات الأم على الأنسجة المنزرعة معمليا ويمكن توضيح ذلك فيما يلي:

1. مرحلة النمو والتطور

يمر النبات بمرحلتين محددتين في تطوره عقب تكوين الزيجوت وحتى الوصول إلى مرحلة البلوغ وهو ما يعرف بـ ontogeny أو ontogenesis. وتسمى المرحلة الأولى التي تكون عقب الإنبات بطور الصبا أو juvenile stage، أما المرحلة التالية وهي مرحلة النضج والقدرة على التكاثر الجنسي فتسمى بمرحلة البلوغ maturity stage. ومن الصعب إيجاد طريقة لدفع النبات إلى الأزهار في مرحلة الصبا وقبل الوصول إلى مرحلة البلوغ . ويتم التعبير عن أي من الطورين بعدد من الجينات ذات التعبير الثابت في الخلايا الميرستيمية في القمم النامية. وبانقسام تلك الخلايا ينتقل هذا التعبير إلى الخلايا الجديدة وبالتالي عبر التكاثر الخضري حيث يمكن الاحتفاظ بهذا التعبير لمدة طويلة أو قصيرة على أساس الظروف البيئة. ولكل مرحلة من مراحل النمو صفات ظاهرية أو وظيفية تميزها عن الأخرى، وقد تكون الفروق بين المرحلتين واضحة أو متداخلة. ففي طور البادرة تكون هناك صفات ظاهرية أو وظيفية تختلف تماماً عن تلك الموجودة في النبات البالغ، لكن قد يكون من الصعب تحديد النقطة الانتقالية بين الطورين، فقد يحدث تغيير تدريجي في بعض أو كل هذه الصفات بدخول النبات مرحلة البلوغ.

هذا وتختلف مدة كل طور باختلاف الأنواع النباتية، ففي الأشجار يستمر طور الصبا فترة طويلة تصل إلى عدة سنوات أما في العشبيات فإن مدة هذا الطور تكون أقصر بكثير، والنباتات ذات الحولين بالطبع لها طور صبا أطول من الحوليات. كذلك تتباين الصفات الظاهرية المحددة لكل طور باختلاف الأنواع النباتية وتتضمن تغيير في شكل الورقة وتركيبها لون الأوراق، نوع الكيوتيكل، وجود الأشواك، زاوية نمو الأفرع طول السلاميات وغيرها من الصفات المختلفة باختلاف الأنواع. وأغلب النباتات في مرحلة الصبا لها قدرة عالية على تكوين جذور على العقل علاوة على قلة إفراز المواد الفينولية، ويجب أن تؤخذ تلك الاعتبارات في الحسبان أثناء الإكثار الدقيق. وقد تؤدى زراعة الأنسجة إلى تحول النباتات من طور الصبا إلى طور البلوغ، ويفسر ذلك في المخروطيات بقلة المجموع الجذري المتكون في النباتات الناتجة معمليا عن تلك الناتجة من البذور. وهناك بعض المعاملات تتبع لدفع النبات إلى التحول مرة أخرى إلى طور الصبا. ولما كانت النباتات التي في مرحلة الصبا ذات صفات مفضلة للإكثار الدقيق ومحددة لنجاح زراعة الأنسجة من حيث قدرتها على تكوين الجذور، الأشطاء وكذلك الأجنة الجسدية (1993 ,George).

لكن ليس من الضروري كما تشير الكثير من الأبحاث أن تقل القدرة على التكشف عموماً وتكشف الجذور بالتحديد في مزارع الأنسجة وباستعمال وسط نمو محدد بوصول النباتات مرحلة البلوغ وغالباً يتم ذلك باستعمال بيئات غنية في السيتوكينينات التي من شأنها تحفيز عودة الخلايا إلى طور الصبا. وهذا ما وصل إليه (2004) Monteuuisin فقد قام بزراعة العقل الساقية من أشجار Acacia mangium في طوري البلوغ والصبا لمدة ثلاث سنوات بهدف تنشيط نمو البراعم العرضية. وبالرغم من المعدل الأعلى لتكوين الجذور والأشطاء للمُستأصلات في طور الصبا (5.5 فرع/ مستأصل) ونسبة تجذير 90% في مقابل 3.9 فرع/ مستأصل ونسبة تجذير 77 % للمُستأصَلات المأخوذة من أمهات في طور البلوغ، فإنه الفرق لم يكن معنويا. لكن كان تأثير الظلام وتركيز الأملاح بالبيئة أهمية في التجذير حتى في حالة استخدام أمهات في طور الصبا. وربما يرجع ذلك إلى اختلافات في أيض المركبات المختلفة باختلاف طور النمو. ويضيف Ballester et al 1999 أن السبب في نقص القدرة على التجذير في مرحلة البلوغ إنما يرجع إلى تغير في التركيب التشريحي. وفي دراسة لأشجار Castanea sati يبلغ عمرها 80 سنة تبين عدم وجود اختلاف جوهري في القطاع العرضي للسيقان المأخوذة من التاج أو من الأفرع التي نمت في قاعدة الجذع وهى تصنف على أنها في طور الصبا. وأمكن دفع الخلايا في كلا النوعين إلى الانقسام بعد فترة وجيزة من المعاملة بالأوكسينات إلا أن تكوين المبادئ الميرستيمية للجذور تم في السيقان الأحدث بعد ثلاثة أيام من المعاملة وتكون الجذر بالفعل بعدد عشرة أيام. لكن رغم انقسام الكامبيوم في الأنسجة البالغة لم تتكون المبادئ الميرستيمية للجذور وذلك على الرغم من ارتفاع محتوى تلك الأنسجة من IAA وكذلك المركبات عديدة الأمين. ومن العوامل التي تستخدم في مزارع الأنسجة حتى تستعيد النباتات مرحلة الصبا (rejuvenation)

أ. الاستطالة الإظلامية: من المعروف أن الإضاءة المنخفضة أو الظلام يؤديان إلى استطالة الأفرع وشحوب لونها Etiolation ، وتكون الأوراق المتكونة صغيرة الحجم وغير كاملة الانبساط وتستعمل هذه الظاهرة في زراعة الأنسجة للتخلص من بعض المسببات المرضية، وقد تكون الاستطالة ضرورية لسهولة تقسيم الساق إلى عدد من العقد لاستخدامها في الإكثار. وتعمل هذه الظاهرة على تحول القمم الميرستيمية من النباتات المأخوذة في طور البلوغ إلى طور الصبا. وفي دراسة لإكثار المانجو في القوارير وجد (2008) .Krishna et al أن عمر نباتات المانجو الأم يلعب دور هام في الاستجابة لزراعة القوارير. واختلف معدل بقاء الأنسجة حية عقب الزراعة على أساس الحالة الفسيولوجية والتي ترتبط بدورها بالتطور في عمر النبات وبالرغم من اعتبار كلا المصدرين صغير العمر إلا أن النباتات التي نمت في البيت المحمي كانت تبدو من النظرة الفسيولوجية ومحتوى النباتات في المركبات الثانوية أصغر من تلك في الحقل المفتوح وبالتالي كانت استجابتها أفضل. حيث فشلت المُستأصلات التي كان مصدرها الحقل في النمو عقب الزراعة. وقد أضاف أن تلقيح النباتات في الحقل بفطريات mycorrhiza يحسن من استجابتها في زراعة الأنسجة باعتبار أن تلك الفطريات تلعب دوراً في زيادة تحمل النباتات للإجهاد ومنه زراعة الأنسجة، إلا أن ذلك يحتاج إلى مزيد من الأبحاث. وقد قام بمقارنة محتوى المُستأصلات النباتية للنبات النامية بالحقل من المواد الفينولية وتأثيرها على استجابتها في القوارير وكيفية التغلب على ذلك باستخدام الاستطالة الإظلامية حيث تم تغطية السيقان الحديثة سريعة النمو بأكياس سوداء اللون لمدة أسبوع قبل استعمالها للزراعة، أو معاملة النسيج بإضافة مضادات الأكسدة. وكان لمنع الضوء عن المُستأصلات النباتية تأثير واضح في خفض محتواها من المواد الفينولية نتيجة نقص الإنزيمات المسئولة عن ذلك وبالتالي تقليل موت الأنسجة عقب الزراعة.

ولتوضيح أثر الإظلام على مراحل زراعة الأنسجة المختلفة قام Karam (2000) &Al-Majathoub بتنمية أبصال Cyclamen persicum في بيئة رطبة في الظلام أو تحت إضاءة للحصول على أعناق الأوراق واستعمالها للإكثار الدقيق. وأشارت النتائج إلى انخفاض معنوي في نسبة التلوث الداخلي بالكائنات الدقيقة عند استعمال الأجزاء المستطيلة إظلامياً. وأضاف أيضاً أن نسبة الأجزاء المكونة للأشطاء كانت 32 % ومتوسط عدد الأشطاء 0.86 لكل مستأصل نباتي مقابل 7 % وكان متوسط عدد الأشطاء 16. 0 لكل مستأصل نباتي مأخوذ من النباتات النامية في الضوء. أما الأشطاء النامية في الظلام فكان وزن وحجم الكالس المتكون منها بعد 8 أسابيع هو 0.3 جم (1.40 سم3) مقابل 0.02 جم ، (0.03 سم3) للأشطاء النامية في الضوء على التوالي. وكذلك تبين وجود تداخل بين ظروف الإظلام والمعاملة بمنظم النمو TDZ، ولعل هذا يرجع إلى انخفاض مستوى IAA الداخلي نتيجة الظلام.

ب. التقليم: تجدر الإشارة إلى أن التقليم الجائر للأشجار يحفز تكوين أفرع جديدة على الجذع وفي قاعدة الساق وتتسم هذه الأفرع بعلامات طور الصبا. وقد تمكن (2005) .Rathore et al من الإكثار الدقيق لأشجار Citrus limon المسنة بعد تقليم الأفرع في الخريف واستعملت الأفرخ حديثة النمو في الشتاء كمصدر للعقد الساقية للزراعة في القوارير وتمكنت الأشطاء المتكشفة من تكوين الجذور. ولعل السبب يرجع إلى حدوث تغيير في نسبة منظمات النمو والمركبات الأخرى في الأفرع حديثة النمو عقب التقليم.

ج. التطعيم: من الثابت ارتباط ضعف تكوين الجذور على العقل بدخول النبات في طور البلوغ ويمكن بتطعيم البراعم أو العقل الساقية المُستأصلة من الأشجار البالغة على بادرات حديثة النمو استرداد تلك العقل القدرة على تكوين الجذور طبقا لما هو معروف من تأثير الأصل على الطعم. ويعتبر النجاح في هذا من التطبيقات العملية لزراعة الأنسجة فالكثير من الأشجار غير نقية التركيب الوراثي ولا تثمر أو تتضح قيمتها الاقتصادية إلا بعد فترة قد تصل إلى سنوات وعندها تكون فقدت القدرة على التكاثر الخضري. وعلى الرغم من نجاح (2006) .Chabukswar et al في دفع المُستأصلات النباتية لأشجار Garcinia indica عمرها 20 عام من تكوين براعم عرضية واستطالة تلك الأفرع إلا أنه كان من الصعب دفع تلك الأشطاء إلى التجذير. وللتغلب على ذلك قام بتطعيم عقل ساقية من الأشجار البالغة على بادرات حديثة الإنبات وقد لاحظ تكوين الكالس في منطقة التحام الأصل مع الطعم مما يشير إلى نجاح التطعيم. وبعد شهرين تقريباً قام بفصل البرعم الطرفي وأعاد تطعيمه على بادرات جدية وبتكرار ذلك خمس مرات أصبح بمقدرة العقل تكوين الجذور. تمكن (Revilla et al. 1996 & b) من استرداد طور الصبا المتمثل في مقدرة العقل على تكوين مجموع جذري ونمو البراعم الجانبية لصنف الزيتون Arbequina. بتطعيم العقل الطرفية بطول 1سم مأخوذة من أمهات مسنة على أفرع في طور الصبا تم الحصول عليها من إنبات الأجنة في المعمل ثم إكثار الأفرع الناتجة بالعقل الساقية. وبالمثل استردت أفرع أشجار Sequoia sempervirens طور الصبا من حيث قوة النمو وتكوين الجذور على العقل عند تطعيم عقل طرفية بطول 1.5 سم على سيقان حديثة النمو في القوارير وتكرار التطعيم أربع مرات. وكانت قوة نمو النباتات الناتجة تعادل أو تزيد النباتات النامية من البذور وقد صاحب ذلك تغير في بروتين الأوراق (1992 ,.Huang et al) .

د. منظمات النمو: إن معاملة النباتات البالغة بمنظمات النمو وخاصة السيتوكينينات عن طريق الحقن أو الرش يؤدى إلى الارتداد جزئياً أو كلياً إلى طور الصبا وامتد تأثير هذه المعاملة إلى عدد الأفرع المتكشفة (1993 ,George). وتزيد فاعلية هذه الطريقة عندما يتم تطبيقها مع معاملات الظلام. وقد استردت المُستأصلات المأخوذة من أشجار Frazinus angustifolia البالغة طور الصبا عندما وضعPerez Parron et al (1994).  العقل الساقية في ماء مقطر مضاف إليه 4.4 مليمول من BA و 5.4 مليمول من NAA و 14.4 مليمول من GA3. وبالفعل تم تأكيد دور الهرمونات وخاصة السيتوكينينات في مراحل التطور للأشجار وكانت النسبة بين (isopentenyladenine-type ²(iP-type و (zeatin-type (Z-type في أشجار Pinus radiata ذات أهمية في تحول الأشجار لطور البلوغ وذلك بتقدير محتوى العقل الطرفية من نباتات بالغة ومحتوى نفس العقل بعد تطعيمها على نباتات في مرحلة الصبا، وقد سجل انخفاض في محتوى السيتوكينينات بدخول الأشجار مرحلة البلوغ (2003 ,.Valdés et al).

هـ. الحرارة العالية: تعمل الحرارة العالية عن المعدل الطبيعي على تشجيع تكوين أفرع ذات صفات الصبا من النباتات البالغة وقد أورد (2008) Preece عدة أمثلة ناجحة لذلك لكن دون تفسير واضح لفعل الحرارة.

ويتضح مما سبق تأثير طور النمو على مزارع الأنسجة في مرحلتي التأسيس والنمو التكشف. وتعد الأنسجة الميرستيمية كنسيج الكامبيوم من الأنسجة التي يمكن استعمالها لإنتاج مزارع ذات قدرة عالية على التكشف من الأشجار المسنة، أما تأسيس المزرعة باستعمال القمم الساقية للأشجار المسنة فهي عملية صعبة وغير ناجحة في معظم الحالات. ومن الصعوبات التي تحول دون استخدام الأنسجة البالغة هو إفرازها لمواد فينولية والتي تسبب تسمم للنسيج وتغير لون البيئة إلى اللون الأسود أو البني، أما الأفرع في طور الصبا يقل إفرازها لهذه المواد وفضلا عن صعوبة استعمال الأنسجة المسنة كمصدر للزراعة فأن معدل نموها وتكشفها يكون منخفض. أما أنسجة الزيجوت والأجزاء المأخوذة من البادرات الحديثة الإنبات فلها قدرة عالية على التكشف والتجذير وتكوين الكالس.

2. تأثير الجنس

من المتوقع أن يكون هناك تأثير للجنس على زراعة النباتات في القوارير لارتباط ذلك بالمحتوى الهرموني للنبات والأحماض الأمينية والبروتينات والعديد من نواتج الأيض 2003 Prakash. ومن ثم أشار Llorente & Apostolo (1998) إلى التباين في تأثير منظمات النمو في الإكثار الدقيق على أساس جنس أشجار Simmondsia chinensis وقد تبين بالفعل التباين في القدرة على التكشف بين النباتات المذكرة والمؤنثة في بعض النباتات أحادية الجنس. لكن لم يلاحظ Welander & Negash (2005) فرق بين الأشجار المذكرة والمؤنثة Hagenia abyssinica ونظرا لصعوبة التفريق بين النباتات المذكرة والمؤنثة في العديد من النباتات فإن تحديد طريقة مثلى لإكثار النباتات المؤنثة ستساهم بلا شك في إنتاج نباتات ذات فائدة اقتصادية. ولدراسة تأثير جنس النبات المستخدم على تكشف الأشطاء من البراعم الجانبية لخمسة طرز وراثية من نبات الهوهوبا ، قام (2004) Tyagic & Prakash بزراعة عقد الساقية من نباتات مذكرة وأخرى مؤنثة في بيئة MS محتوية على تركيزات مختلفة من BA. وتشير النتائج المبينة في الجدول التالي إلى اختلاف استجابة الطرز الوراثية، كما تباين عدد الأشطاء المتكشفة من كل جزء نباتي على حسب جنس النبات الأم، وكان أعلى عدد للأشطاء وهو 10 لكل جزء نباتي عند زراعة أجزاء من النباتات المذكرة للطراز الوراثي 99692 EC في بيئة محتوية على 10 ملجم لكل لتر من BA و 9.3 لكل جزء نباتي عند زراعة أجزاء من النباتات المؤنثة للطرز الوراثي 171284 EC. وأوضحت الدراسة أيضاً إلى أن المحتوى العالي من السيتوكينينات في النباتات المذكرة قد يكون هو سبب استجابتها العالية بالمقارنة مع النباتات المؤنثة مع الأخذ في الاعتبار الفروق بين الطرز الوراثية المختلفة.

جدول يبين تأثير جنس النبات والتركيب الوراثي و BA على تكشف الأشطاء من العقد الساقية لنبات الهوهوبا (2004 Tyagi & Prakash).

لكن في معظم الحالات تستجيب النباتات المؤنثة بصورة أفضل من المذكرة. وعلى الرغم من العديد من الدراسات التي اهتمت بدراسة إكثار أشجار الهوهوبا المذكرة والمؤنثة فهناك تعارض في إمكانية تحديد بعض المؤشرات للتفريق بين جنس النبات في المراحل الأولى من النمو في مزارع الأنسجة. ويبين Prakasha et al (2003) وجود تباين في استجابة العقد الساقية من كلا الجنسين للنمو والتفريع في القوارير باختلاف الأملاح المعدنية في البيئة، وحتى لتركيز الفحم المنشط وPVP الذي استخدم للتغلب على المواد الفينولية. وقد خلصت الدراسة إلى إمكانية استعمال وسط MS المضاف إليها 5% من لبن جوز الهند أو 0.005 ، 00,25 ، 00,05 ، 0.075 ، 0.1 مليمول من PVP لتحديد جنس النباتات في السلالة 33198 من الهوهوبا. وفي استعراضه للدراسات الأخرى في هذا الصدد أشار إلى وجود اختلاف في محتوى الأوراق والأزهار من الفينولات على العكس من إنزيم البيروكسيديز والبروتين الكلى. أما الكالس المتكون من نباتات Actinidia deliciosa المذكرة فقد احتوى على ضعف تركيز الإنزيم السابق بالمقارنة مع كالس النباتات المؤنثة.

3. معاملة النبات الأم والأجزاء المفصولة قبل التعقيم

تتوقف التطورات التي تحدث للنسيج عقب الزراعة على الحالة الفسيولوجية للنسيج والتي بدون شك ترتبط بالمعاملات التي تتم للنباتات مصدر المُستأصل النباتي، وكذلك الظروف البيئية المحيطة وفى معظم التجارب كان أحسن جزء نباتي هو المأخوذ من نباتات خالية من الأمراض والإصابات الحشرية وأي نباتات مصابة بمرض يجب التخلص منها إلا إذا كانت هناك ضرورة قصوى لذلك. لأن هذا النسيج يموت غالباً وإن نجحت زراعته فهناك نسبة عالية من احتمال انتقال المرض إلى النباتات الناتجة والتي يكون عددها قليل وحجمها أصغر مقارنة مع تلك المتكشفة من الأنسجة السليمة، ويتوقف ذلك على نوع المسبب المرضى والعائل. وفي حالة حدوث تلوث داخلي لابد من إتباع الطرق الموصى بها للتغلب عليه كالمعاملة بالمضادات الحيوية أو المطهرات السطحية. وبصور عامة لا يفضل استعمال النباتات النامية في الحقل المفتوح لأنها أكثر عرضة للتلوث، علاوة على صعوبة التحكم في العوامل المختلفة التي تؤثر في النمو. ومن الناحية التطبيقية فإن النباتات العشبية يمكن تنميتها في ظروف متحكم فيها على العكس من الأشجار. وإن كان من الضروري الاعتماد على الأشجار المسنة لكونها نادرة مثلا أو ذات طرز وراثية مفضلة فتؤخذ العقل وتزرع للحصول على أفرع حديثة تستخدم براعمها الجانبية للإكثار الدقيق. ويعاب على هذه الطريقة طول المدة التي تمر من أخذ العقل حتى إمكانية الحصول على البراعم الجانبية وتقدر هذه المدة في بعض هجن الكافور بـ 8 - 12 شهر.

ولما كانت معظم الأشجار تنمو في مناطق بعيدة عن معامل الإكثار الدقيق فإن الأجزاء المفصولة قد يصيبها الذبول. كما تزيد نسبة حدوث التلوث الداخلي خلال الـ 72 ساعة التالية للفصل وقبل تعقيم وزراعة الأجزاء المفصولة. وقد قام .Watt et al (2003) بمقارنة نقل الأجزاء المنتخبة للزراعة وهى عبارة عن عقل بها برعم واحد أو ثلاث براعم من أشجار Eucalyptus grandis النامية في البيت المحمي بعد معاملتها ببعض المضادات الفطرية إلى المعمل وقد تم تغليف العقل في البولي إثيلين أو زرعت في زجاجات زراعة محتوية على 3 - 4 جم فيرموكيوليت معقم ومبلل بالماء. وكانت نسبة التلوث مرتفعة تصل إلى 50-57% عند لف الأجزاء النباتية في البولي إثيلين مقارنة بالطريقة الأخرى. كذلك كانت نسبة تفتح البراعم في حال استعمال زجاجات الزراعة 51-55% على حسب طول العقلة مقابل 20 - 34 % في حالة استعمال البولي إثيلين. وفي نفس الدراسة قام الباحث بفصل أفرع تحتوي على برعم طرفي وبطول حوالي 100 مم. ثم قسمت الأفرع لنوعين من العقل الأول طولها 20-35 مم عبارة عن برعم واحد في إبط ورقة تم إزالة نصفها العلوي. أما النوع الثاني فكان عقل طولها 35 - 50 مم بها ثلاث براعم وتم إزالة جميع الأوراق من عليها. ورشت الأجزاء المفصولة بالماء المقطر المعقم أو بالكحول 70 % وحفظت في زجاجات الزراعة أو في البولي إثيلين لمدة 48 ساعة على درجة حرارة 24 - 26 م في الظلام. وأعقب ذلك إجراء التعقيم السطحي والزراعة في بيئة الإكثار. وتوضح النتائج المدونة في الجدول التالي، أثر المعاملات السابقة على تلوث المزرعة في مراحل نموها المختلفة وتفتح البراعم وعدد الأشطاء المتكونة. وتشير النتائج إلى انخفاض معنوي في نسبية التلوث وزيادة عدد الأشطاء المتكشفة من الجزء النباتي برش الأجزاء المفصولة بالكحول ونقلها إلى المعمل في أوعية محتوية على فيرموكيوليت معقم.

وهناك كثير من الأبحاث التي تشير إلى تأثير معاملة النبات المصدر ببعض المعاملات لتشجيع التكشف، فمثلا سجلت زيادة في عدد الأشطاء المتكشفة عند معاملة نباتات الفاصوليا التي استعملت كمصدر للأجزاء النباتية أثناء مرحلة إنبات البذور بمنظمات النمو BA و CPPU و TDZ . وأشار البعض إلى دور السيتوكينينات في هذه المرحلة في حث انقسام الخلايا المؤهلة للتكشف. وكان تأثير المعاملات مقتصر على الأجزاء المكونة للبذور وليس على الأوراق التي تتكون لاحقا.

4. الظروف البيئية التي ينمو فيها النبات الأم

يتم التحكم في النمو بعديد من العوامل الداخلية التي ترتبط بدون شك بالعوامل الخارجية. فهناك ارتباط بين تغذية وري النبات الأم والحالة الفسيولوجية للنسيج وبالتالي استجابة المُستأصل النباتي، حيث تؤثر التغذية والري في مدى تركيز العناصر الغذائية ومنظمات النمو في الأنسجة النباتية. وقد أدى تغيير معدل التسميد بالأسمدة المختلفة وخاصة النتروجيني إلى تغيير الاستجابة الحادثة للنسيج المنزرع. والعامل الآخر الذي يتداخل مع تغذية وري النبات الأم هو ميعاد أخذ النسيج، فمن الطبيعي أن الإجهاد المائي ودرجات الحرارة وطول الفترة الضوئية وشدتها والطول الموجي تتغير على مدار العام وربما في اليوم الواحد. ويؤدى هذا التغيير إلى اختلاف في محتوى النبات الأم وأنسجتها من منشطات ومثبطات النمو والمواد الكربوهيدراتية والنيتروجينية، كما يؤثر أيضاً على معدل حدوث التلوث المرضى الموجود بالنسيج. ومن هذا يتضح أن التوليفة المثلى من العوامل البيئة التي ينمو فيها النبات الأم خاصة النامية بالحقل والتي تساعد على النمو والتكشف في زراعة الأنسجة متباينة ومتداخلة مع بعضها ومن الصعب التحكم فيها. لذا يفضل أن تؤسس المزرعة من نباتات تنمو تحت ظروف المعمل (1993 ,George).

جدول يبين: تأثير نوع المُستأصل النباتي لأشجار Eucalyptus grandis وبعض المعاملات قبل التعقيم على استجابته للإكثار الدقيق (2003 ,.Watt et al).

* T1 عقلة بها برعم واحد في إبط ورقة تم إزالة نصفها العلوى، T2 عقلة بها ثلاثة براعم وتم إزالة الأوراق من عليها، المعاملات ** A1 رش الأجزاء المفصولة بالماء المقطر المعقم، A2 رش الأجزاء المفصولة بالكحول 70 %، S1 حفظت الأجزاء في البولي إثيلين ، S2 حفظت الأجزاء في فيرموكيوليت معقم ومبلل بالماء.

ولعل تأثير فصول السنة المختلفة على الاستجابة في مزارع الأنسجة يتضح بشدة في الأشجار النامية في المناطق التي يتضح فيها الفرق بين فصول السنة المختلفة. ويؤكد ذلك (2007) Kartsonas & Papafotiou عند زراعة البراعم المفصولة من بادرات حديثة الإنبات أو نباتات بالغة لأشجار Quercus euboica حيث شاهد اختلاف في قدرة البراعم المفصولة في شهور مختلفة من أمهات بالغة أو بادرات حديثة الإنبات في البيت المحمي على تكشف الأشطاء في القوارير (الجدول التالي). كما بين وجود تداخل بين العمر وميعاد أخذ المُستأصَلات، بينما لم يكن هناك تأثير لتوقيت أخذ المُستأصلات أو عمر الإنبات الأم على عدد الأشطاء المتكشفة. وتشير كثير من الأبحاث إلى أن الأجزاء المأخوذة عند بداية موسم النمو أو أثناء موسم النمو غالبا ما تكون ذات قدرة أعلى على النمو من تلك المأخوذة في نهاية موسم النمو. لكن استنتج (1998) .Lardet et al أن هناك قدرة عالية لبراعم أشجار Heved brasiliensis و Theobroma cacao التي تم الحصول عليها أثناء طور السكون على التفتح والنمو بالمقارنة مع البراعم التي تم جمعها أثناء طور نمو الأوراق أو الساق. وقد امتد نفس التأثير عند إعادة تقسيم الساق وزراعته حيث كان عدد البراعم والأشطاء المتكشفة أعلى عند استعمال البراعم التي في طور السكون كمستأصل نباتي لتأسيس المزرعة. وربما يرجع ذلك إلى التغير الكبير في محتوى النبات من السكريات والمركبات الأخرى المصاحبة لبدء النمو عقب السكون.

جدول يبين: تأثير عمر النبات الأم وميعاد أخذ المُستأصلات النباتية من أشجار Quercus euboica على التكشف في القوارير Kartsonas & Papatotion (2007).