الأمراض المتسببة عن البكتريا الفاقدة للجدار الفايتوبلازما والسبايروبلازما

Diseases Caused by Mollicutes Phytoplasmas and Spiroplasmas

بذل العلماء جهودا مضنية من أجل تشخيص أمراض الاصفرار المصحوبة بأعراض النخر والتقزم وفرط النمو والتي لم تشخص مسبباتها كونها ليست من الفطريات أو البكتريا أو الفايروسات.

فقد تصدى الباحث L.O. Kunkel لمشكلة تشخيص مسبب مرض اصفرار الأستر (نبات زينة) منذ أواسط سنوات 1920 وحتى سنوات 1950 ليثبت أن مسبب المرض هو عامل معدي ينتقل بواسطة نطاطات الأوراق المتغذية على لحاء النباتات وإن تسخين الناقل إلى درجات حرارة تحت قاتلة تفقده القدرة على نقل المسبب وإحداث المرض، لكنه يستعيدها بعد فترة من الإنعاش في درجات الحرارة المناسبة مما يرجح ان المسبب يتكاثر داخل عامل النقل الحيوي.

إن هذه الملاحظات تدفع للاعتقاد بأن المسبب يكون فايروس بعد أن استبعدت المسببات الأخرى. غير أن إثبات عدم تسبيب الفايروس للمرض لم يتحقق إلا في نهاية 1960 حيث لم يفلح الباحث الياباني Doi في توضيح وجود جسيمات الفايروس في صور المجهر الإلكتروني لكن الصدفة التي جمعت Doi مع متخصص الأحياء الدقيقة البيطرية Koshimizu الذي كان يعمل على المايكوبلازما الحيوانية Mycoplasma gallisepticum شاهد صور المجهر الإلكتروني واشار إلى ان الجسيمات التي هي بحجم الميتاكوندريا مشابهة للمايكوبلازما هذه الملاحظة حفزت Doi على تجريب تأثير المضاد الحيوي Tetracycline الذي أزال أعراض المرض ورجح ان يكون المسبب هو مايكوبلازما. سمي المسبب في البداية (PPLOs) Pleuropneumonia-Like Organisms او (Organisms (MLOs Mycoplasma-Like بسبب التشابه الظاهري مع المايكوبلازما ثم سميت (Sears & Kirkpatrick, 1994; Fletcher & Wayadande, 2002) Phytoplasma

إن هذا العمل فتح الباب أمام تشخيص العديد من الأمراض التي كان يعتقد انها عن فايروسات وتبين انها متسببة عن فايتوبلازما لكن عدم النجاح في زراعة هذه المسببات المرضية على الأوساط الزرعية صعب عملية دراستها والتي سهلت فيما بعد بواسطة الطرق الجزيئية.

في سبعينات القرن العشرين تم اكتشاف مجوعة من الأحياء القريبة الممرضة للنبات سميت بالسبايروبلازما (Spiroplasma) كونها تتألف من خلايا رفيعة حلزونية خالية من الجدار الخلوي أول اكتشاف لها كان على نبات الذرة المصاب بمرض تقزم الذرة وهو مرض مهم في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية. لكن هذه الأحياء يمكن تنميتها على الأوساط الزرعية.

اشتق اسم Mollicutes من الكلمات اللاتينية molli وتعني لين و cute وتعني جلد لتغير عن كونها فاقدة للجدار. يضم الصنف Mollicutes المايكوبلازما والفايتوبلازما والسبايروبلازما. فهذه الأحياء بدائية النواة تفتقد جدار الخلية وتشترك بصفات خلوية وجزيئية غير اعتيادية مقارنة بالبكتريا الأخرى بما فيها البكتريا اللامية (L-Form Bacteria) التي هي بكتريا تفتقد الجدار الخلوي جزئيا أو كليا.

إن فقدان هذه الأحياء للجدار الخلوي الذي يكسب الخلية شكلا محددا جعل خلاياها متغيرة الشكل (Pleomorphic) حيث يتأثر بالبيئة المحيطة، وهي تكون حساسة للأزموزية لأهمية الجدار في تكوين ضغط الامتلاء ومقاومة للمضادات الحيوية التي تعمل على تثبيط تكوين جدار الخلية البكتيرية مثل البنسيلينات، المايكوبلازما والسبايروبلازما قابلين للزرع على أوساط زرعية خاصة تتطلب وجود مواد معينة من بينها السترولات بينما لا يمكن زراعة الفايتوبلازما.

بكتريا Mollicutes تمثل أصغر الأحياء الخلوية حيث تتراوح أقطار خلاياها بين 0.3 إلى 1.2 مكم وصغيرة الجينوم الذي تتراوح كتلته بين ⁸10 و ⁹10 دالتون وحجمه في حالة فايتوبلازما دغل برمودا هو 350 ك ق. وفي حالة المايكوبلازما Mycoplasma genitolium يساوي 580 ك ق مقارنة ببكتريا Escherichia coli البالغ 4600 ك ق. ويتميز جينوم هذه الأحياء بانخفاض نسبة القواعد G+C حيث تساوي 23 - 41%. ومن الملفت أن المايكوبلازما والسبايروبلازما (وليس الفايتوبلازما) تستخدم الشفرة الوراثية المعروفة UGA (التي تستخدمها الأحياء الأخرى كشفرة "توقف" الترجمة) لتشفير الحامض الأميني Tryptophan، وتحتوي خلايا العديد من هذه الأحياء على معلومات وراثية إضافية خارج الكروموسوم بشكل فايروسات وبلازميدات يمكن أن تندمج بسهولة مع DNA البكتريا وتكسبها صفات مختلفة.

إن هذه المجموعة من الأحياء ترتبط تطوريا مـع البكتريا الموجبة لصبغة كرام (2002 ,Fletcher & Wayadande). هذا التطور الاختزالي تم خلاله فقدان البكتريا الفاقدة للجدار الجزء مهم من كروموسوم أسلافها واحتفظت بالجينات الضرورية للحياة. هذا الاختزال الوراثي تم من خلال التكيف مع الطريقة الطفيلية في الحياة. هذا ادى إلى عدم حاجة البكتريا إلى الجينات المسؤولة عن العديد من المسارات البنائية ما جعلها لا تتمكن من النمو على الأوساط الزرعية خصوصا في حالة الفايتوبلازما الشيء الذي يزكي نجاحها التطوري هو سعة انتشارها في الطبيعة. ويبدو أنها تتوجه نحو الحياة التعايشية كونها لا تؤذي حشراتها الناقلة بينما تسبب أمراضا على الحيوانات والنباتات (2007,Razin).

تصنيف الأحياء التابعة إلى صنف Mollicuites (الجدول التالي) يعتمد على إجراء جملة من الاختبارات تشمل تحليل تتابعات جين S rRNA16 وتهجين DNA - DNA (DNA-DNA) hybridization (DDII) والاختبارات المصولية والمعطيات المظهرية المتوفرة (2007,Stackebrandt et al., 2002: Brown et al).

إن أنواع Mollicules تكون حساسة للمضادات الحيوية من نوع تتراسايكلين وحساسة للمعاملة بالحرارة حيث أن معاملة التقاوي المصابة بدرجات حرارة 30 إلى 37 م لفترات مختلفة تتراوح بين الأيام، الأسابيع أو الأشهر والغمر بالماء بدرجة حرارة 30 إلى 50 م لدقائق أو ساعات كفيل بتخليصها من المسبب المرضي (1997 Agrios).

جدول يبين: التصنيف والخواص الرئيسة لصنف Millocutes

عن: (Razin et al., 1998)

الفايتوبلازما (Phytoplasma)

استخدم مصطلح Phytoplasma ليضم جميع الأحياء البدائية النواة الفاقدة للجدار الخلوي وغير اللولبية الشكل (غير السبايروبلازما) والتي تستعمر لحاء النباتات وكذلك الحشرات والتي كانت تسمى سابقا "الأحياء الشبيهة بالمايكوبلازما". من أهم المشاكل التي تعترض دراسة الفايتوبلازما هو عدم قدرتها على النمو على الأوساط الزرعية وبالتالي تصعب كثيرا إمكانية كشفها، إنها طفيليات مجبرة.

تشخيص الفايتوبلازما يعتمد على الأعراض والاستجابة للمضاد الحيوي التتراسايكلبين وعدم الاستجابة للبنسيلينات والطرق المناعية (ELISA) والتصوير بالمجهر الإلكتروني غير أن تأكيد التشخيص يتم من خلال عزل الحامض النووي والتعرف على تتابعاته وتشخيص البوادئ المميزة (PCR) واستخدام طرق Restriction Fragment Length Polymorphisms(RFLP) لتشخيص انواع وسلالات الفايتوبلازما، وتتوفر طرق QPCR و Bioimaging لتقدير شدة الإصابة من خلال تركيز الفايتوبلازما في مخفف (تايتر) النسيج المصاب (2004 ,.Christensen et al).

أظهرت التحليلات الجزيئية أن هذه الأحياء تمثل فرع (Clade) متميزة أحادية الأصل التطوري ضمن الصنف Mollicules، وضمت الفايتوبلازما التي تشترك بتشابه يزيد عن 97.5% في تتابعات جين 16 S rRNA ضمن الجنس الجديد Candidatus (Ca). Phytoplasma

هذا الجنس يضم في الوقت الحاضر الأنواع Ca. Phytoplasma aurantifolia مسبب مرض مكنسة الساحرة على الليمون الحامض الصغير الثمار و .Ca Phytoplasma australiense مسبب مرض اصفرار الكريب فروت الأسترالي و .Ca. Phytoplasma fraxini مسبب اصفرار الدردار و Ca. Phytoplasma japonicum المصاحب لمرض تورق نبات Hydrangea الياباني و Ca. Phytoplasma brasiliense المصاحب لمرض مكنسة الساحرة على نبات Hibiscus في البرازيل و "Ca. Phytoplasma castaneae المصاحب لمرض مكنسة الساحرة على الكستناء في كوريا و Ca. Phytoplasma asteris المصاحب لمرض اصفرار الأستر و Ca. Phytoplasma mali المصاحب لمرض فرط النمو في التفاح و Ca. Phytoplasma phoenician المصاحب للمرض المميت في اللوز و Ca. Phytoplasma trifolii المصاحب لمرض فرط النمو في البرسيم و Ca. Phytoplasma cynodontis المصاحب لمرض الورقة البيضاء في دغل برمودا و Ca. Phytoplasma ziziphi المصاحب لمرض مكنسة الساحرة في نبات jujube و Ca. Phytoplasma oryzae المصاحب لمرض تقزم واصفرار الرز، إضافة إلى ذلك ثمة 6 أنواع أخرى محتملة كما توجد انواع تظهر تشابه في تتابعات جين S rRNA16 تزيد عن 97.5 % لكنها تمتلك صفات بيولوجية وإمراضيه ووراثية مميزة.

كما توجد انواع تقل فيها نسبة التشابه الوراثي المطلوب عن 97.5 % The IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team-Phytoplasma Taxonomy Group, 2004

وسع (2007 ,.Wei et al) من استخدام الطرق الجزيئية (RFLP) عن طريق المعالجة الحاسوبية لأكثر من 800 تتابع لجين S rRNA16 للفايتوبلازما المتوفرة حينها من خلال برنامج CLUSTAL X و pDRAW32 حيث يجرى تقطيع in silico وترحيل جيلي افتراضي. مكن هذا الأسلوب من تصنيف مئات الفايتوبلازما غير المصنفة سابقا وخرج بتشخيص 10 انواع 7 منها جديدة ليصبح عدد الأنواع المشخصة 28. غير أن تشخيص انواع جديدة من الفايتوبلازما عملية مستمرة حيث تم تشخيص نوع جديد في عمان هو Candidatus Phytoplasma omanense المسبب لمرض مكنسة الساحرة على نبات Al-Saady er ol., 2008) Cassia italica).

يمكن اعتبار الفايتوبلازما بكتريا فقدت الجدار الخلوي ومحاطة فقط بغشاء الخلية لذلك تكون متغيرة الشكل كالبالون المملوء بسائل. اكتشفت سنة 1967 في لحاء النبات الذي اعتقد انه مصاب بفايروس كما سبق ذكره. الفايتوبلازما خلايا صغيرة جدا قطرها أقل من 1 مكم وجينومها صغير يتراوح حجمه 530 إلى 1350 ك ق ونسبة القواعد A + T في الجينوم تكون عالية، إضافة إلى احتوائها على جينات إضافية محمولة على بلازميدات توجد الفايتوبلازما في مئات الأنواع من النباتات مسببة الكثير من الأمراض وكذلك في الحشرات.

الفايتوبلازما صغيرة الجينوم وهي تستخدم الشفرة UGA بمعنى "توقف" وليس تشفير الحامض الأميني تربتوفان على خلاف بقية أنواع Mollicutes وكما في بقية الأحياء الأخرى ( 2003 ,.Nishigawa et al).

صورة بالمجهر الالكتروني الماسح لفايتوبلازما نقية، × 2500

صورة بالمجهر الالكتروني تبين وجود الفايتوبلازما (السهام) في خلايا لحاء نبات الصندل (Sandal) × 3000

يقتصر وجود الفايتوبلازما على نسيج اللحاء الناقل لمنتجات التركيب الضوئي في النبات.

لاحظ (1998 ,.Siddique et al) أن الأنبيب المنخلية التي تحتوي على الفايتوبلازما لا يتأثر تركيبها بينما تنهار الأنابيب المنخلية المجاورة غير المحتوية على الفايتوبلازما كما ان الأنسجة المظهرة للأعراض يمكن أن تحتوي على تراكيز قليلة أو لا تحتوي على الفايتوبلازما مما يرجح تكوينها أو حثها العائل على إنتاج السموم.

الفايتوبلازما تسبب اعراض الاصفرار وتقزم النمو والتدهور البطيء خصوصا في الأشجار وتشوش النمو كالنمو المفرط للسيقان والبراعم والتورق (Phylloidy) أو النمو الورقي من الأجزاء الزهرية.

يختلف المدى العوائلي للفايتوبلازما حسب السلالة بين الضيق والواسع الطيف وهذا بدوره مرتبط بالحشرة الناقلة.

تنتقل الفايتوبلازما من نبات إلى نبات بواسطة الحشرات خصوصا نطاطات الأوراق ونطاطات النبات التي تتغذى على عصارة اللحاء كما تنتقل الفايتوبلازما بواسطة التطعيم.

تكتسب الحشرة الناقلة الفايتوبلازما عند التغذي على نباتات مصابة لبضع ساعات أو أيام ولا تتمكن من نقلها إلا بعد 10 إلى 45 يوما اعتمادا على درجات الحرارة التي تكون فيها الدرجة المثلى 30 م والصغرى 10 م. هذا يعني وجود عملية تكاثر وتوزع للفايتوبلازما داخل الحشرة الناقلة، وبعد اكتساب الحشرة للفايتوبلازما تتمكن من نقلها طيلة حياتها في الكثير من الحالات لا تؤثر الفايتوبلازما سلبيا على عامل نقلها الحيوي لكن في بعض الحالات تسبب المايكوبلازما امراض مهمة على الحشرات (1997,Agrios).

السبايروبلازما (Spiroplasmas)

يعود جنس Spiroplasma إلى عائلة Spiroplasmataceae. السبايروبلازما أحياء بدائية النواة بعضها يصيب النبات بينما أنواع اخرى تسبب امراض على الإنسان أو الحيوانات كما توجد أنواع منها منابتة على سطوح النباتات خصوصا الأزهار التي ربما تتلوث بها عن طريق الحشرات. معظم أنواعها تصاحب الحشرات المختلفة بما فيها نحل العسل وذبابة الفاكهة (Drosophila) والتي تعتبر نواقلها الحيوية وبذلك تعتبر من الأحياء الواسعة الانتشار. السبايروبلازما يمكن أن تكون ممرضة أو مآكله أو مرافقة للحشرات. معظم السبايروبلازما النباتية تنتقل بواسطة نطاطات الأوراق (1997,Bove).

خلايا السبايروبلازما حلزونية بينما تفتقد هذه الصفة داخل حشراتها الناقلة، أبعادها 2-4 X 0.08 0.2- مكم. السبايروبلازما لا تمتلك اسواط لكنها تتحرك حركة انتقالية بدوافع الاستقطاب الكيميائي وتأثير عوامل البيئة. ثمة نوعين من الحركة الأولى لولبية سريعة تنشأ نتيجة دورانها حول محورها المركزي والثانية بطيئة متموجة تنشأ عن الانحناء والانبساط تتكاثر السبايروبلازما بواسطة الانشطار.

اكتشفت السبايروبلازما في سبعينات القرن العشرين اثر تشخيص مسبب مرض تقزم الذرة S. kunkeli ثم S. citri مسبب مرض العناد في الحمضيات و S. phoeniceum على نباتات الحلزون Fletcher & Wayadande, 2002) (Periwinkle)). وعلى الرغم من اكتشاف السبايروبلازما كمسببات لأمراض النبات إلا أن عدد الممرضات النباتية كما هو واضح قليل مقارنة بعدد أنواع السبايروبلازما المشخصة 40 نوعا على الأقل (2005 ,.Joshi et al).

شكل يبين: السبايروبلازما في خلايا لحاء الذرة المصابة

عن: (2000,Davis)

تسبب السبايروبلازما الكثير من الأمراض على العديد من أنواع النباتات (2002 ,Gasparich, 2002 Fletcher & Wayadande). تتركز إصابات السبايروبلازما في أنسجة اللحاء مشاركة النبات في نواتج التركيب الضوئي من السكريات وغيرها من المواد الغذائية. إن معظم إصابات السبايروبلازما تسبب أعراض الاصفرار والتقزم والذبول والموت التراجعي ونخر اللحاء وانهيار الأنابيب المنخلية والخلايا المرافقة وترسب الكالوس في اللحاء وانهيار النبات وموته.

أنواع السبايروبلازما النباتية الثلاثة يمكن زراعتها على الأوساط الزرعية حيث تكون مستعمرات صغيرة جدا قطرها بحدود 0.2 ملم بشكل البيضة المقلية كما في المايكوبلازما أو بشكل حبيبي.

المايكوبلازما (Mycoplasma)

المايكوبلازما احياء بدائية النواة خالية من الجدار وتعتبر أصغر الأحياء الخلوية ابعادها 0.2 إلى 0.8 مكم. كما أنها تمتلك أصغر جينوم بين الأحياء الخلوية لذلك فهي تفتقر للعديد من المسارات الأيضية الموجودة في الأحياء الأخرى وهذا يؤدي إلى ضعف قدرتها على النمو على الأوساط الزرعية وضرورة توفير العديد من المواد في هذه الأوساط الخاصة من أجل تحقيق النمو (1997,Fox ,2007 ; Agrios). يعتقد العلماء بان نشوء المايكوبلازما تم عبر التطور الاختزالي من البكتريا الموجبة لصبغة كرام عن طريق فقدان الكثير من الجينات والاحتفاظ بالجينات الأساسية للحياة Razin et al,. 1998)). ومما ساعد على ذلك الطبيعة التطفلية للمايكوبلازما حيث تحصل على نواتج العمليات الأيضية الكثيرة التي تعمل في الخلايا العائلة لها.

شكل المستعمرة على وسط النمو يكون بهيئة " البيضة المقلية " وهي صغيرة جدا وتحتاج إلى 3 أسابيع من أجل الظهور ونظرا لافتقادها للجدار فهي متغيرة الشكل بين الكروية والكمثرية والخيطية المايكوبلازما تحتاج إلى السترولات من أجل النمو وتكوين غشاء الخلية. تتكاثر المايكوبلازما عن طريق التبرعم والانشطار الثنائي العرضي، المايكوبلازما لا تكون اسواط ولا أبواغ وهي سالبة لصبغة كرام.

يتم التفريق بين الأنواع الثلاثة الممرضة للإنسان على أساس استغلال الكلوكوز أو الأرجنين أو اليوريا. معظم المايكوبلازما المعروفة لحد الآن ممرضة للإنسان حيث تسبب أمراض المجاري التنفسية والبولية وللحيوانات مسببة امراض عصبية وشريانية والمترمم منها يمكن أن ينمى على أوساط زرعية خاصة.

من عوامل إمراضيه المايكوبلازما البروتين اللاصق P1 ونواتج ايضية سامة تتمثل ببيروكسيد الهيدروجين والسوبر أوكسيد التي تؤكسد دهون العائل وتحفيز تفاعلات مناعية في العائل يمكن أن تسهم في الإمراضية. المايكوبلازما مقاومة تماما للبنسيلين لكنها حساسة للتتراسايكلين والكلورامفينيكول والأرثرومايسين وبعض المضادات الحيوية الأخرى (1997 ,Fox ,2007 : Agrios)

البكتريا اللامية

L-Form Bacteria

يرجع تاريخ ملاحظة فقدان الأحياء الدقيقة لجدار الخلية إلى سنة 1852 عندما لاحظ M. Perty الأجسام الكبيرة (Large Bodies) وظهر مصطلح الشكل اللامي (L- form) عندما لاحظت Emany Klieneberger تكوين البكتريا Streptobacillus monitiformis المستعمرات صغيرة إلى جانب المستعمرات الطبيعية ووجدتها مشابهة للمايكوبلازما كونها فاقدة للجدار. وقد أطلقت عليها تعبير L-form مستخدمة الحرف الأول من اسم المعهد الذي تعمل به وهو معهد Lister من باب الوفاء. علما ان هذه الظاهرة تحصل في بعض انواع البكتريا التي تتعرض لعوامل محللة أو مثبطة لتكوين مواد الجدار كما تحصل أيضا في بعض أنواع الفطريات.

ومع أن صفة فقدان الجدار يمكن أن تنتقل لأجيال ضمن النوع البكتيري المعني إلا أنها ليست ذات أصل وراثي بل تحت التأثير البيئي. ونظرا للاختلافات في تركيب جدران خلايا البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة كرام فإن العوامل المؤدية إلى فقدان الجدار فيها ستكون مختلفة أيضا في الوقت الذي يفسر (1975.Butler& Blakey) عدم ملاحظة البكتريا اللامية في الغالب خلال عمليات العزل المكروبي بسبب عدم القدرة على النمو على الأوساط الزرعية الروتينية، يذكر (Agrios1997) إمكانية نمو البكتريا الفاقدة للجدار على الأوساط الزرعية البسيطة التي تنمو عليها البكتريا الأصلية.

إن المتغيرات البيئية بما فيها البيئة الداخلية للعائل يمكن أن تجعل البكتريا تتغير مظهريا وفسلجيا من أجل البقاء بصورة كامنة والتكاثر وإحداث المرض عند توفر الظروف المناسبة خصوصا في حالات معاودة الإصابة ( Domingue & Woody 1997. ومع ان الشكل اللامي للبكتريا يمكن أن يحصل خارج الجسم الحي عن طريق المعاملة بالمضاد الحيوي البنسلين إلا ان حدوثه داخل الجسم الحي ممكن ايضا بفعل الابتلاع الخلوي والفايروسات البكتيرية والعلاج ببعض المضادات الحيوية ودفاعات العائل الأخرى (1975 ,Butler& Blakey).

إن حالة فقدان الجدار قد تكون مؤقتة تزول بزوال المادة المؤثرة وترجع البكتريا إلى حالتها الطبيعية أو تكون دائمة بسبب عدم القدرة على الرجوع إلى الشكل الأصلي. من البكتريا الممرضة للنبات والتي تظهر الشكل اللامي البكتريا Agrobacterium tumefaciens مسببة مرض التدرن التاجي ويكون الشكل الفاقد للجدار مسببا للمرض أيضا ويمكن عزله من الورم ومعاودة زرعه و Erwinia caratovora pv. atroseptica مسببة مرض الساق الأسود في البطاطا (1997,Agrios).