الاكثار الدقيق للنباتات Plant Micropropagation

ان التكاثر في النبات على وجه العموم يتم بطريقتين اما التكاثر الجنسي وفيه النباتات تنتج من البذور الناتجة من اتحاد الجاميطات الابوية (المذكرة والمؤنثة) وفي معظم الاحيان فان البادرات الناتجة من البذور تكون مختلفة عن بعضها وراثيا وكل واحدة تمثل تركيبا جينيا تم احداثه بواسطة الانقسام والطريقة الثانية هي التكاثر اللاجنسي (الخضري) بدون تغيير او تعديل في تركيبه الوراثي ويتم التكاثر خلال الدرنات او الكرمات او الفسائل وغير ذلك ومجموعة النباتات الجديدة الناتجة مشابهة للنباتات الاصلية.

المقصود بالتكاثر الدقيق micropropagation هو انتاج عديد من النباتات المطابقة تماما في تركيبها الوراثي لنفس النبات الاصلي الممتاز والمراد تكاثره سواء هذا النبات ناتج عن طريق برنامج التربية او من اي وسيلة تقليدية اخرى او من وسائل الهندسة الوراثية في النبات.

يتم الاكثار في مزارع الانسجة النباتية بطريقتين اما تكوين النموات الجانبية او تكوين النموات العرضية على هيئه اجنة عرضيةSomatic- Embryogenesis  في الحالة الاولى يتم زراعة قمه مرستيمية او قمة نامية وهذه تنتج نباتات اقل في الاختلافات الوراثية ولكن معدل التضاعف اقل (شكل 1و2).

وفي الحالة الثانية يستخدم اي جزء نباتي (قمة مرستيمية – قمة نامية – جزء من الورقة - جزء من عنق الورقة - جزء من الساق ... الخ) حيث يمر بمرحله انتاج الكالوس – وتنتج في هذه الحالة نباتات اكثر في الاختلافات الوراثية عن الطريقة الاولى ولكن معدل التضاعف يكون اكثر.

ويقسم الاكثار عن طريق تكوين النموات العرضية الى:

۱- طريق مباشر:

وفي هذه الحالة يتكون الجنين مباشرة من خلية او نسيج بدون تكوين كالوس، وتسمى هذه الخلايا التي تعمل على تكوين الاجنة pre-embryonic cells مثل خلايا النيوسيلة في الموالح واوراق واعناق نباتات الفيكس ليراتا والبيجونيا والبنفسج الافريقي وذلك عند الزراعة في البيئة المناسبةCooke, 1977, Anderson and Mielke, 1985) ).

٢- طريق غير مباشر:

في هذه الحالة يتكون الكالوس اولا وهو عبارة عن مجموعة من الخلايا البرانشيمية غير المتكشفة وعند ما تتكشف تسمي هذه العملية differentiation او التكشف. ثم تتكون الاجنة بعد ذلك عندما تجد البيئة والظروف المناسبة لذلك وتسمى الخلايا التي تتكون منها الاجنة في هذه الحالة embryogenic cells.

مثال ذلك: تكوين الكالوس من ورقة الفيكس ليراتا Ibrahim and Nasr El Din, 1990)) وتكشفه الى نباتات او من انسجة اللحاء في الجزر او تكوين الكالوس من القمة النامية في النخيل.

 (Thrope, 1981, Murashige and Huang, 1987, Ibrahim, 2008)

شكل (1) القمة الطرفية لنبات الفيكس التي تحوى القمة المرستيمية.

شكل (2) القمة المرستيمية للنبات كما تظهر باستخدام الميكروسكوب الالكتروني الماسح وهي تظهر القمة النهائية للنبات يحيط بها الوريقات الاولية النامية

يحدث التكاثر الدقيق في المزارع بواحدة من ثلاث طرق وهي:

۱- من خلال الكالوس:

ان القدرة الفائقة للخلايا النباتية على التكاثر في المزارع وانتاج نسيج الكالوس تعطي فرصة كبيرة لإنتاج اعداد كبيرة من النباتات من هذه الخلايا لدى حدوث التميز النباتي بها ويحدث التميز اما بتكوين الجذور والنموات الخضرية مباشرة واما من خلال تكون الاجنة الجسمية ويعد الاكثار من خلال نسيج الكالوس اسرع طرق الاكثار الدقيق الا ان هذه الطريقة غير مفضلة لما هو معروف عن الكالوس من عدم ثباته الوراثي حيث تظهر به حالات مختلفة من التضاعف الكروموسومي كما ان الكالوس لم تتميز به نموات نباتية في عديد من المحاصيل الهامة الى الان وتعد هذه الطريقة هي الوحيدة المستخدمة لإكثار انواع مهمة مثل الموالح، النخيل والقهوة كما ذكر في بعضي المراجع ولكن لا يمنع من استخدام طرق اخري

(Murashige 1974, Ammirato, 1993, Ibrahim 2008)

۲- من خلال تكوين البراعم العرضية:

على الرغم من ان النباتات التي من انسجة الكالوس تعد عرضية المنشأ الا انه يعني بالبراعم العرضية تلك التي تتكون من العضو النباتي مباشرة دون ان يفصل بينهما نسيج الكالوس وتتكاثر اعداد كبيرة جدا من النباتات الاقتصادية بهذه الطريقة. (Thorope, 1981,Goerge, 2008)

3- من خلال تحفيز التفرع الجانبي:

يتم تحفيز النمو الجانبي في المزارع بتوفير السيتوكينين بها بتركيز معين اما مع الاوكسين واما بدونه ويؤدي استمرار توفر السيتوكينين في المزرعة الى نمو البراعم الجانبية التي تتكون في القمة المرستيمية التي تنمو من البراعم المزروعة (اي من الnodal segments ) ثم تنمو البراعم الجانبية التي تتكون في القمم المرستيمية الجديدة. وهكذا يؤدي استمرار هذه العملية لعدة مرات الى تكون كتله من النموات الجديدة وبرغم توقف تكاثر المزرعة الواحدة بهذه الطريقة بعد فترة الا انه يمكن استمرار التكاثر في هذه المرحلة بنقل اجزاء من المزرعة الى مزارع اخري جديدة وبذلك يمكن استمرار التكاثر الى مالا نهاية الى درجة انه يمكن على سبيل المثال انتاج من 15 –25 مليون نبات فراولة من نبات واحد في العام لان كل نبات يكون قادرا على انتاج 10 نباتات جديدة كل اسبوعين.Boxus et al, 1977) ).

تعد عملية التجذير ضرورية في الحالات التي لا تنمو فيها النباتات من الاجنة الجسمية بينما توجد الجذور طبيعيا في حالة التميز من الجنين الجسمي الذي يحتوي بطبيعته على جذير ولأحداث التجذير يلزم نقل النموات المتكونة الى بيئة اخرى تختلف في مكوناتها الهرمونية عن بيئة التكاثر ويكون نقل النموات الخضرية عادة الى هذه البيئات وهي بطول حوالي 1 سم ثم تنقل النباتات بعد تكون جذورها الى اصص معقمة بحرص تام وتتعهد بالرعاية الى ان تكبر حيث تنقل بعد ذلك الى البيوت المحمية (الصوبات الزراعية).

وعامة نادرا ما يستخدم طريق تكوين الاجنة الخضرية  somatic embryogenesis لإكثار النباتات في مزارع الانسجة النباتية (1993 ,Ammirato ,1993, George)، وذلك للأسباب الاتية:

1– صعوبة تكوين الاجنة الخضرية لكثير من النباتات.

٢- احتمالية حدوث الطفرات اثناء تكوين الاجنة الخضرية.

۳- صعوبة الطريقة (تكوين الكالوس - تكشفه - ثم تكوين النموات).

4– فقد الحيوية وتجديد النباتات مع تكرار عمليات النقل.

5– قد يحدث سكون مع استخدام طريقة تكوين الاجنة الخضرية والذي من الصعب

كسره.

كل ذلك جعلنا نلجأ الى استخدام الطريقة الاولى (تكون النموات الجانبية).

ان الاكثار الدقيق ما هو الا نوع من التضاعف الذى يحافظ على الصفات ويكون متطابقا مع الاصل true to type وفيه يتم انتقاء سلالات منتخبة من نباتات تتكاثر خضريا وتستخدم تقنيات زراعة الانسجة في المعمل in vitro ومعظم الاكثار الدقيق يتوجه الى الاكثار الكمي للنباتات مع الوضع في الاعتبار لأسعار الوحدات النباتية المنتجة بهذه الطريقة وايضا نباتات مميزة وخالية من المسببات المرضية Thrope 1981, Jha and Ghosh, 2005))

ومن المعروف ان طريقة التكاثر الخضري بالوسائل التقليدية عن طريق الفسائل او الدرنات او الكرمات او غير ذلك تعد من الوسائل البطيئة لدرجة انها لا تفي بالدرجة الكافية بالطلب المتزايد على النباتات، مما قد يدفع الكثير من الدول الى استيراد هذه النباتات من الخارج بالإضافة الى ان بعض هذه النباتات صعبة الاكثار وعلى هذا فقد ادى استخدام طريقة زراعة الانسجة الى انتاج اعداد كبيرة من النباتات المختلفة في مجالات ومحاصيل الخضر والزينة والفاكهة في المعمل وفي مساحة محدودة مع الحفاظ على صفاتها الوراثية ومطبقاتها للنبات الام وايضا باستخدام طرق الاكثار الدقيق امكن اكثار بعض نباتات الغابات الخشبية حيث ان بعضها لا ينجح بالتطعيم كما انه ليس من السهل تكوين جذور على العقل وبالتالي يمكن زيادة الثروة الخشبية وغير ذلك من مميزات استخدام الاكثار الدقيق. هناك بعض النباتات التي تنتج من البذور ولكن قدرتها على الانبات تكون منخفضة جدًا وبالتالي يمكن تكاثرها بسهولة عن طريق استخدام طرق متخصصه للإكثار الدقيق حيث يمكن اضافة بعض المغذيات او الاضافات الاخرى للبيئة Debergh and) Maene, 1981, Rugini, 1984, Kyte, 1987 and Skirvin, et al., 1990)

بعض النباتات قد تحتوي على صفات خاصة ربما نتجت عن طفرة جينية مستحدثة او ذاتية وقد لا يمكن الحصول عليها مرة اخرى وبالتالي يجب ان تتكاثر خضريا للاحتفاظ بتلك الصفات.

خلال برامج انتاج الهجن يكون فيها انتاج البذور مكلفا حيث ان انتاجها باستمرار من الاباء الداخلة في انتاج الهجين وخاصة في حالة النباتات التي لم يوجد بها ظاهرة العقم الذكري وبالتالي فان استخدام الاكثار الدقيق كوسيلة في انتاج عدد كبير من نبات هجيني واحد يقلل من تلك التكاليف.

افتراض موراشيجي 1974 ان مراحل الاكثار الدقيق للنباتات تمر بثلاث مراحل ولكن تراكم المعلومات بعد ذلك ادى الى القبول بخمس مراحل تؤدي الى نجاح هذا الاكثار. فقد اضيف مرحلة تمهيدية اطلق عليها (0 Stage) كما اضيف ايضا مرحلة رابعة قبل اقلمة النباتات بالصوبة (1989 .Torres).

قبل البدء بمراحل الاكثار يوجه الاهتمام الى اختيار النباتات الملائمة للإكثار حيث يجب ان تحمل المواصفات القياسية للنباتات وايضا يجب ان تكون خالية من المسببات المرضية والآفات وغالبا يتم اختيار نباتات مميزة elite وممثلة للصنف والسلالة (Thorpe 1981, Murashige and Huang, 1987)

اولا المرحلة التمهيدية: 0 Stage

هذه المرحلة توجه اساسا الى علاج ما يسببه التلوث الفطري والبكتيري من مشاكل ومن المعروف عند انهاء نباتات المصدر او نباتات الام تحت شروط النظافة aseptic condition وعدم وجود مصادر للتلوث يؤدي ذلك لتخفيض نسبة التلوث المبدئي عند اخذ النموات من هذه النباتات وخاصة التلوث الفطري (1981 Debergh and Maene) ولكن في حالة الاصابات البكتيرية التي قد تكون بكتيريا تلوث خارجية او انها تكون داخل انسجة النبات فلا يمكن في هذه الحالة التكهن بالنتيجة المتوقعة.

وفي هذه المرحلة ينصح بأنماء النباتات في الصوبة طالما امكن ذلك بعمل عقل من الاشجار المختارة وتجذيرها بالصوبة او استخدام شتلات مطعمة في بعض الاحيان كمصدر نظيف لأخذ المنفصل النباتي (explant) ويراعى في الصوبة الا تزيد درجة الرطوبة النسبية عن 75% ودرجة الحرارة حوالى ٢٥ م مع الاعتناء بالري عن طريق التنقيط وليس الري بالرش او الضباب مع مراعاة عمل برنامج وقائي لمكافحة الفطريات والبكتيريا بالصوبة. وهذا النظام يمكن تعديله حسب نوع النباتات النامية في الصوبة وان الفترة المقترحة تحت هذا النظام لا تقل عن ثلاثة اشهر قبل اخذ المنفصلات النباتية.

هناك عديد من الاشارات الى انه يمكن التحكم في الاضاءة ودرجة الحرارة واستخدام منظمات النمو خلال نمو هذه النباتات في الصوبة للحصول على منفصل نباتي explant ملائم وذي مواصفات قياسية. فقد ذكر ان المنفصلات المأخوذة من اوراق البيجونيا للنباتات النامية في الصوبة تحت نظام حرارة مرتفعة واضاءة يوم طويل اعطت نتائج متميزة عند استخدامها في الاكثار المعملي.

كما وجد ان تعريض ابصال الليليم الى درجة حرارة منخفضة اثناء التخزين ( 4م) كان له اثر جيد على اكثار هذا النبات في المعمل (1981 Stimart and Ascher) ومن ناحيه اخري قد استخدم 1984 Vogenlmann et al تركيزات مختلفة من  BAللمساعدة على اكثار وتكشف انواع من اشجار المخروطيات.

وفي بعض الاحيان حين يتعذر انهاء النباتات في الصوبات الزراعية او عدم توفرها يمكن رش الاشجار بالمبيدات الفطرية واخذ النموات الجديدة للإكثار، كذللك يمكن تغطية بداية الافرع الحديثة على الشجرة بواسطة اكياس شفافة وبعد فترة يمكن الحصول على نموات حديثة تكون نظيفة وقليلة التلوث او رش النموات الحديثة بمادة الجبريلين GA₃ للإسراع في استطالة الافرع واخذ الاطراف او استخدام اكياس سوداء فتنمو الافرع باستطالة لوجودها في الظلام واخذ القمم النامية فتكون اقل تلوثا. كل هذا يساعد في هذه المرحلة على تحسين اداء المنفصل النباتي وايضا يرفع نسبة الحياة والبقاء لهذه الاجزاء النباتية (Survival).

ثانيا: مرحلة التأسيس للإكثار: 1 Stage

والهدف من هذه المرحلة الحصول على مزرعة معقمة خالية من التلوث الفطري والبكتيري ويكون المنفصل النباتي ذا حيوية وكفاءه جيدة.

ومن العوامل التي تؤثر على نجاح هذه المرحلة هو الجزء النباتي المستخدم ويقصد به المنفصل النباتي "explant" (قمة نامية - قمة مرستيمية) وهذا من العوامل المحددة لنمو النبات وتكشفه. من ناحية عمر المنفصل النباتي، عادة يفضل استخدام المنفصل النباتي صغير السن، وفي بعض الاحيان يفضل اجراء عملية التطويش لتكوين نموات حديثة اكثر نشاطا عند زراعتها.

ويمكن كذلك الحصول على النموات الحديثة القوية بأجراء عمليات التطعيم (الاصل الصغير المطعم من النبات الكبير) مثل الاوفوكادو وبعض اصناف نباتات الغابات وفي بعض الاحيان تحتاج لعمليات التطعيم عدة مرات، وكذلك معاملة النباتات بالجبريلين GA₃ وفي احيان اخري تستخدم مركبات السيتوكينين حيث يشجع ذلك علي تكوين النموات الحديثة وذلك كما تم ذكره في المرحلة السابقة.

وجد انه كلما زاد حجم المنفصل النباتي كانت نسبة النمو اعلى في معظم الحالات وكذلك يكون معدل التضاعف اعلى ولكن يعاب على هذه الطريقة نسبة التلوث العالية - بينما يفضل ان يكون حجم المنفصل النباتي صغيرا وذلك لخلوه من الامراض وقلة التلوث.

تكون الاعضاء النامية اكثر نشاطا في بداية موسم النمو عن بقية السنة والنباتات النامية في حالة نشاط في الصوبة او في الحضانات يقل نشاطها بتقلبات الفصول ويتوقف نجاح النمو في مزارع الانسجة على ميعاد الحصول على المنفصل النباتي، وهذا يتوقف على طبيعة نمو كل نبات.

يجب ان يكون مصدر النبات مطابقا للأصل تماما وفي حالة نمو جيد وخال من الامراض، وهناك بعض المعاملات التي تجرى قبل الزراعة المعملية للمصدر النباتي مثل المعاملات الحرارية والتسميدية او الرش بالمبيدات او خلافه.

ومعظم المشاكل في هذه المرحلة هي التلوث الناتج في مرحلة التعقيم السطحي وكذلك اكسدة المركبات الفينولية بالنسيج النباتي مسببة اللون البني ويمكن التغلب على هذه المشكلة جزئيا باستخدام مضادات الاكسدة في ماء النقع المستخدم في عمليات التعقيم او مباشرة في البيئة، وتختلف عملية التعقيم باختلاف المعامل وتفضيلها للطريقة المناسبة لها.

والوقت المطلوب لاكتمال المرحلة الاولى يتوقف على نوعية النسيج المستخدم والهدف من الزراعة – فمثلا اذا بدانا بقمة مرستيمية meristem فانها تحتاج الى 2-3 اشهر حتي يتكون فرع صغير بطول 1-3 سم، بينما اذا بدانا بالقمة النامية Shoot tip فأنها تحتاج لحوالي شهر فقط الا ان هناك نباتات قد تحتاج الى ستة اشهر او اكثر كما يحدث عند اكثار النخيل (2008 ,Ibrahim).

ثالثا: مرحلة التضاعف: 2 Stage

الهدف من هذه المرحلة هو الزيادة العددية السريعة للنموات الخضرية وللأجنة والتي في النهاية تعطي النباتات، وفي بعض الاحيان تكون بيئة البداية (المرحلة الاولى) هي بيئة المرحلة الثانية كما يحدث في البطاطس - وبعد وقت محدد للمنفصل النباتي في البيئة يبدا نمو البراعم الجانبية وتصبح كثيرة ويمكن تحقيق مرحلة التضاعف بتشجيع نمو البراعم الجانبية او العرضية.

ولتشجيع تكوين النموات الجانبية، تفصل الافرع المتكونة حديثا وتنقل منفردة الى بيئة جديدة والعامل المحدد لنجاح هذه المرحلة هو تركيز ونوع منظمات النمو والنسبة بين الاوكسين والسيتوكينين وفي نهاية هذه المرحلة التي تكرر عدة مرات فيما يسمى "Sub culture" وهي حوالي ٦ مرات في الموز تحصل على عدد وفير من النموات الخالية من الامراض تمهيدا لإدخالها في المرحلة التالية للنموTeisson and Cote, 1997) )

فلو فرض نظريا ان معدل التضاعف = 3 نباتات جديدة في النقلة الواحدة فانة يمكن حساب عدد النموات المتوقع تكوينها بعد عدد نقلات محدد كما يلي:

عدد النموات الجانبية الجديدة = معدل التضاعف عدد مرات النقل مثال:

نقل النبات 5 مرات = 3 ⁵          = 243 نمو جانبي جديد.

 6 مرات = 3 ⁶                     = 739 نمو جانبي جديد.

 7 مرات = 3 ⁷                     = 2187 نمو جانبي جديد.

 8 مرات = 3 ⁸                     = 6561 نمو جانبي جديد.

ولكن نظرا لاحتمال حدوث تباين او اختلاف بعد ذلك للنباتات النامية فان هذا التباين والاختلاف يسمي"Somaclonal variation" ويفضل عدم زياده عدد مرات النقل حتى لا يظهر فيها هذا التباين والذى يتوقف غالبا على:

۱) زياده تركيز مركبات السيتوكينين المستخدمة.

۲) زياده عدد مرات النقلي.

٢) نوع وطبيعة الصنف النباتي.

وغالبا ما تستخدم مركب بنزيل ادينين او الكينيتين وهما من مركبات الستوكينين الصناعية وفي بعض الاحيان النادرة تستخدم بعض مركبات السيتوكينين الطبيعية مثل: ايزونيل ادينين - زيتين - زيتون ريبوزيد.

رابعا: مرحلة التجذير : 3 Stage

الهدف من هذه المرحلة هو تجهيز واعداد النباتات بصورة صالحة للنقل للتربة، حيث تتوقف طريقة الاكثار الناجحة باستخدام تكنيك زراعة الانسجة على الاعداد الجيد لهذه النباتات وذلك بتجذيرها حيث تزيد نسبة الاوكسين في البيئة في هذه المرحلة ويقل او لا يضاف السيتوكينين الي مكونات البيئة (2009 ,Tereso et al, 2008. Gantait et al).

ويجب معرفة طبيعة النباتات، فمثلا النباتات التي بها سكون يجب كسره بالتعرض لدرجات الحرارة المنخفضة لفترة زمنية معينة. وفي بعض النباتات نعمل على تقليل كمية السيتوكينين والاملاح في البيئة وزيادة الاضاءة لتنشيط انزيمات البناء الضوئي ولزيادة الكفاءة التمثيلية للنباتات فيسهل اقلمتها (Wardle et al. 1983.b). وفي بعض الاحيان تنقل النباتات مباشرة من المرحلة الثانية الى التربة مباشرة مع استخدام هرمون تجذير (Driver, 1985)

خامسا: مرحلة اقلمة النباتات: 4 Stage

تتعرض النباتات الصغيرة او الافرع النامية في المعمل في البيئات الصناعية لظروف بيئية محددة ومتحكم فيها وتختلف الى حد ما عن البيئة الطبيعية للنمو حيث تتعرض الى قدر من الضغوط التي تواجهها في الطبيعة بالإضافة الى قربها من البيئة والظروف المثالية التي تساعد على التكاثر والتضاعف للنبات. هذه النباتات الصغيرة تنمو في الاوعية تحت مستويات من الاضاءة الضعيفة وتحت ظروف التعقيم وبيئة غذائية تحتوي على كميات هائلة من السكر والمغذيات المختلفة التي تسمح بالنمو heterotrophic اي غير معتمدة الى حد كبير على التغذية الذاتية او استخدام الضوء للتمثيل الغذائي (autotrophic) وايضا في ظروف رطوبة نسبية عالية. كل هذه الظروف تتسبب في انتاج نباتات ذات شكل مظهري او تركيب تشريحي لا يتوافق مع ظروف البيئة العادية تجعله لا يستطيع التاقلم والحياة عند نقله مباشرة الى الصوبة الزراعية او الحقل. ولذلك يكون من الضروري اقلمة النباتات تدريجيا لتتأكد (شكل 3) من الابقاء عليها حية حتى تكوّن اوراقا جديدة تستطيع ان تستمر في الحياة تحت الظروف الطبيعية لنمو النباتات ,(Wardle et al. 1983a Pospisilova et al., 1999 and Gadalla et al, 2006)

شكل (3) اقلمة النباتات باستخدام الري بالضباب

عموما يلاحظ ان الاوراق المتكونة في المعمل (in vitro) ينقصها تكون كامل للطبقة الشمعية المغلفة لطبقة الكيوتيكل، كذلك فان الثغور لا تعمل بطريقة طبيعية في تنظيم دخول وخروج الهواء وبخار الماء للورقة كما قد يكون التركيب التشريحي لهذه الثغور غير مكتمل، مثل هذه الاوراق تفشل في وظيفتها الطبيعية ويكون النبات في حاجة الى اوراق جديدة تنمو بصورة طبيعية لمواجهة الظروف في الصوبة او الحقل.

وعلى هذا يكون من الضروري توفير ظروف جديدة عند نقل هذه النباتات لأول مرة من المعمل الى الصوبة ولاقلمة هذه النباتات الصغيرة يجب رفع الرطوبة النسبية المحيطة بهذه النباتات وايضا في نفس الوقت خفض شدة الاضاءة لأنه من الضروري محاكاة الظروف الطبيعية التي سوف ينمو فيها النبات في النهاية والخطوة التالية هي تخفيض الرطوبة النسبية العالية تدريجيا وزيادة مستوى الاضاءة التي يتعرض لها النبات في هذه المرحلة(Sutter and Langhans 1979 and Griffis et al., 1980).

اقترح Kozai عام ١٩٨٨ طريقة الاكثار المعملي وتتضمن رفع نسبة ثاني اكسيد الكربون في اواني الاكثار ورفع معدل الاضاءة ونمو النباتات في بيئة بدون سكر وذلك لدفع النباتات للنمو في بيئة شبه طبيعية وكذلك لتشجيعها على النمو كنباتات ذاتية التغذية autotrophic يكون من السهولة اقلمتها بالصوبات بعد ذلك. الا ان هذه الطريقة قد تحتاج الى تقييم من الناحية الاقتصادية مع مقارنة الطريقة العادية التي يتم فيها نمو النباتات في بيئة غذائية تحتوي على مستوى عال من السكر والمكونات الغذائية وايضا مستوي منخفض من الاضاءة ومرتفع في الرطوبة النسبية. ومن ناحيه اخرى قد لا تلائم هذه الطريقة الامكانات المتوفرة في الدول النامية.

في هذه المرحلة (الاقلمة) تنقل النباتات وتزرع في تربة مكونة من البيت موس والرمل بنسبة 2 : 3 واحيانا يضاف بيرليت او فوم لزيادة التهوية ثم ترش بعد ذلك بمحلول غذائي متكامل وغالبا ما تكون النسبة العددية من العناصر الاساسية - النيتروجين - الفوسفور - البوتاسيوم، واحدة واحيانا يستخدم هرمون تجذير لتشجيع تكوين المجموع الجذري وغالبا ما تتم هذه العملية في حضانات مجهزة لذلك مزودة بعدادات لدرجات الحرارة ليلا ونهارا واخرى للرطوبة والاضاءة (شدة - عدد ساعات) وخلافه وذلك على النطاق البحثي، واما على النطاق التجاري فأنها تتم في صوبات مجهزة لذلك وغالبا ما يستخدم نظام الرش بالضباب او التغطية بالأكياس (شكل رقم 3). وهذه المرحلة هي الترجمة النهائية للعمل في مزارع الانسجة النباتية وهي هامة للغاية ويجب ملاحظة ان لكل نبات طبيعة خاصة في الاقلمة وان العشبيات تختلف عن الاشجار وان ذلك يتطلب الخبرة الكافية حتى تأتي بنتائج طيبة في ذلك المجال.

يستفاد من مزارع الاكثار في انتاج سلالات خضرية تحتوي عشرات الالاف من النباتات الصغيرة خلال فترة وجيزة ويفضل دائما استخدام القمة المرستيمية لكي تكون النباتات المنتجة خالية من الفيروسات اما ان لم يكن ضروريا فانه يمكن استعمال اجزاء صغيرة من ساق النبات، تحتوي كل منها على عقدة وبرعم جانبي nodal segments ذلك لان البراعم الجانبية المفصولة بمفردها من الاشجار البالغة لا تنمو في معظم الحالات بينما يساعد النسيج الامامي الموجود مع البرعم الابطي في هذه العقل nodal cuttings على نمو البرعم وتتحمل البراعم الجانبية عملية التعقيم افضل من البراعم الطرفية ويمكن استعمال اي جزء نباتي اخر في التكاثر الدقيق اذا امكن دفعه لتكوين براعم عرضية سواء تكونت من خلال نسيج الكالوس ام بدونه.

التطبيقات الزراعية لتقنية التكاثر الدقيق:

لقد تمكن عديد من الباحثين من تطبيق تقنية التكاثر الدقيق لتحسين الانتاج النباتي في عديد من الانواع النباتية التي تتكاثر خضريا ونخص بالذكر هنا بعض التطبيقات لهذه التقنية. هذه التطبيقات هامة جدا للمحاصيل المنزرعة في بلاد المنطقة العربية ومن امثلتها النخيل، الموز، الفاكهة ذات النواة الحجرية، العنب، والزيتون (Zimmerman and Broome 1980, Hammerschlag, 1982, Debergh and Zimmerman, 1991)

والجدول التالي يبين بعض النماذج لإكثار بعض المحاصيل الاستوائية الهامة في المنطقة الافريقية (شكل رقم 4). ويحتوي الملحق على امثلة تطبيقية لإكثار بعض هذه النباتات وغيرها.

جدول يبين استخدام اسلوب الاكثار الدقيق لبعض المحاصيل الاستوائية وتحت الاستوائية في افريقيا

شكل (4) اسلوب اكثار نباتات الاناناس بالعمل in vitro

1- المنفصل النباتي القمة المرستيمية ٢- مرحله التضاعف

وتعتمد طرق التأكد من المطابقة للصنف ليس فقط على الشكل الظاهري للنباتات الناتجة ومدي انحرافه عن الشكل الميز والذي يمكن استبعاده في الخطوات المتعاقبة للإكثار بل ايضا يعتمد على توافر طرق البصمة الوراثية التي يستخدم فيها تقنيات DNA الحديثة وهي الطريقة المثلى للتأكد من مطابقة الاصل مع ناتج زراعة الانسجة.

ان استخدام الصفات المورفولوجية في التمييز بين الاصناف والطرز النباتية قد لا تصلح في بعض الاحيان حيث يكون التشابه شديدا جدا في الشكل الخارجي وهي طريقة تحتاج الى وقت طويل وتعتمد بدرجة كبيرة على الظروف البيئية المتغيرة. وقد استخدم ايضا بعض الصفات البيوكيماوية مثل المشابهات الانزيمية isozymes وايضا الاختلافات على مستوى محتوى البروتين في الخلية، كل هذه الطرق السابقة لا ترقى الى ان تكون اسلوبا مثاليا للتفرقة بين النباتات وحيث ان النباتات الناتجة عن طريق زراعة الانسجة يمكن ان ينتج عنها اختلافات مورفولوجية ووراثية فانه يستلزم في هذه الحالة استخدام طرق اكثر دقة وذات ثقة في نتائجها النهائية.

اعتمادا على التطور الحادث على مستوى البيولوجيا الجزيئية وابتكار طرق حديثة في التفرقة والتمييز بين الكائنات على اساس المادة الوراثية وهي ثابتة ولا تتأثر بالظروف البيئية كما انها متماثلة في جميع خلايا الجسم وهذه الطرق يطلق عليها البصمة الوراثية Fingerprinting.

هناك حاليا طرق عديدة تقع تحت مسمى البصمة الوراثية اشهرها واقدمها استخداما هي RAPD وهي اختصار Random Amplified Polymorfic DNA بالرغم من ان هذه الطريقة قد تفوقت على الطرق القديمة مثل isozyme والتحليل البروتيني للنباتات الا انه تم اكتشاف طريقة Amplified Fragment Length

(Polymorphism (AFLP وهي الاكثر دقة وكفاءة في الكشف مع الاختلافات الدقيقة بين السلالات النباتية وقد استفادت زراعة الانسجة النباتية باستخدام هذه الطريقة في تأكيد مطابقة الناتج للنبات الاصل.

تم استخدام طرق AFLP , RAPD عند اكثار نباتات نخيل البلح لدراسة الاختلافات الوراثية ونسبتها في ناتج زراعة الانسجة حيث استخدام ۳۷ بادئا Primer في الطريقة الاولى (RAPD) ولم يظهر التحليل اي اختلافات في محتوى الـ DNA للنباتات الناتجة بينما اظهر تحليل الـ AFLP اختلافات في الاصناف من البلح هم: برتمودا – جونديلة – سكوتي ( 1 % - 0.7% – 2.6 %) على التوالي بالرغم من استخدام 13 بريمرا فقط 2006 ,Saker et al. استخدم Saker عام 1995 اختبار RAPD في دراسة التغيرات الوراثية التي ظهرت في نباتات البسلة والفاصوليا الناتجة من الاكثار المعملي ومن ناحيه اخري اظهرت نتائج الاكثار الدقيق لبنجر السكر مطابقة الناتج مع نباتات الاصل عند استخدام عدد قليل من البادئات (2008.Bekheet et al) والجدول التالي يوضح المقارنة بين استخدام الطريقتين.

جدول يوضح مميزات وعيوب كل من طريقة AFLP , RAPD في الكشف عن ناتج زراعة الانسجة. عن سامي عدوي AGERI / ARC

من المتفق عليه حاليا ان استخدام طريقه AFLP اكثر دقة في تحديد الاختلافات ونسبتها في ناتج زراعة الانسجة بالمقارنة بالطرق الاخرى المتوفرة الان ومن المتوقع نظرا للتطور المتلاحق للبيولوجيا الجزيئية ان يتم تحسين اساليب وكفاءة الفحص.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.