يتم صنع العمود الكروماتوغرافي عادة من الزجاج، ويتراوح طوله بين : 30-15سم وقطره حوالي 1.5سم. ويوضع الصوف الزجاجي في نهاية العمود لتثبيت الطور الساكن. ويتم ملء العمود بالطور الثابت، ويراعى أن تكون حبيبات الطور الثابت صغيرة ومتماثلة في الحجم، وأن تكون دائرية ما أمكن. وتوضع المكونات المراد فصلها على الطور الثابت أعلى لعمود ثم يمرر الطور المتحرك. ونتيجة لاختلاف تجاذب المكونات مع الطور الثابت ولاختلاف وزن جزيئات المكونات يتم سريان المكونات داخل العمود بمعدلات مختلفة، حيث إن كل مكون ينفصل عن الآخر في أثناء سيرها داخل العمود متحركة مع الوسط المتحرك إلى أن تصل إلى المقدر وهذا المقدر يسجل إشارة عندما يصل إليه كل مكون من مكونات العينة، وتظهر هذه الإشارات على هيئة منحنيات كروماتوغرافية، وتكون عملية الفصل ناجحة إذا كانت المنحنيات الناتجة متماثلة ومفصولة عن بعضها.