تزيد التنقية من النشاط النوعي

إن الهدف من تنقية الإنزيمات هو عزل إنزيم معين من خلاصة خلوية خام تحتوى على عدد من المكونات الأخرى. ويمكن نزع الجزيئات الصغيرة بواسطة الديال أو الترشيح الهلامي، وتنزع الأحماض النووية بالترسيب بالمضاد الحيوى الستربتوهيسين وهكذا. لكن المشكلة تكمن في فصل الإنزيم المطلوب من بين مئات البروتينات المماثلة له كيميائياً وفيزيائياً.

يظهر (الجدول 8-2) تطور التقنية النموذجية لتنقية أحد الإنزيمات الكبدية. هذا التطور أدى إلى الحصول على نقاوة إجمالية زادت بقدار 490 ضعفاً. لاحظ كيف تم حساب مقدار النشاط والكشف (Recovery) النوعي للنشاط الأولي. والهدف هو الحصول على أقصى نشاط نوعي (عدد وحدات الإنزيم في كل 1 ملج من البروتين)، مع أفضل نسبة كشف ممكنة للنشاط الأولي.

الشكل 8-5 : المقايسة المقترنة لنشاط الهكسوكيناز. يقرن التفاعل بتفاعل محفز بنازعة هيدروجين ابلوكوز - 6 -فسفات (G6P). ويضاف كل من نازعة هيدروجين ابلوكوز — 6 — فسفات وابلوكوز والأتب (ATP) وأيونات المغنزيوم وثنائي نوكليوتيد الأدينين والنيوكوتين أميد المفسفت (+NADP) بكميات زائدة. يسمح ذلك لكمية الهكسوكيناز الموجودة بتحديد المعدل الإجمالي للتفاعل المقترن ومعدل تشكل ثنائي نوكليوتيد الأدينين والنيوكوتين أميد المفسفت الاتزل (NADPH).

يمكن قياس هذا الأخير عند طول الموجة 340 نم.