هناك عدة طرائق يمكن من خلالها تقدير البروتينات وهي :

1- طريقة كلدال Kjeldahl method (قياس النيتروجين الكلي في العينة)

تحتاج هذه الطريقة الى كميات عالية عكس الطرائق التي تستخدم فيها الطرائق الطيفية، ويتم

الطريقة هضم المادة البروتينية مع حامض الكبريتيك المركز بوجود أحد العناصر المعدنية (السلينيوم او النحاس او الزئبق كعامل مساعد، فتتحول المواد النيتروجينية العضوية الى كبريتات الأمونيوم الحامضية كما في المعادلة الأتية:

تعامل NH₄HSO₄ مع هيدروكسيد الصوديوم فيتولد عن ذلك الأمونيا التي تعامل مع محلول حامضي مثل HCl ذي تركيز معلوم.

ومن هذه المعلومات يمكن معرفة وزن النيتروجين في العينة. ولما كانت نسبة النيتروجين في أيـــة مــادة بروتينية تعادل 16% لذا يمكن عندئذ استخراج وزن النيتروجين من حاصل ضرب العامل 6.25 ( أي 16/100) بوزن النيتروجين.

2- امتصاص البروتين للاشعة فوق البنفسجية (UV light) عند الطول الموجي 280 نانوميتر. بما أن وحدات التربتوفان التي لها معامل الحيود (معامل الامتصاص المولاري) (Extination coefficient(s أعلى من بقية الأحماض الأمينية الحلقية لذا فإن معظم امتصاص البروتين للأشعة فوق البنفسجية يعزى الى وحدات التربتوفان. وبهذه الطريقة يمكن قياس كمية البروتين من قياس كمية الأشعة فوق البنفسجية عند الطول الموجي 280 نانوميتر بوساطة المطياف الضوئي Spectrophotometer. إن هذه الطريقة سريعة وبالإمكان استرجاع عينة البروتين بعد التقدير. هناك مركبات أخرى مثل الأحماض النووية تظهر الامتصاصية عند الطول الموجي 260 نانوميتر وهي بهذا تظهر الامتصاصية عند 280 نانوميتر. لذا فإن مقدار الامتصاصية Absorbance لعينة بروتين ما، تحـــــدد عند 280 وكذلك 260 ثم تحسب النسبة بينهما:

واعتماداً على مقدار هذه النسبة يستخرج عامل التصحيح Correction factor مرجعياً. ثم يحسب تركيز البروتين كما يأتي:

تركيز البروتين (ملغم/مل) = عامل التصحيح × الامتصاصية عند 280 نانوميتر

اذ قيمة عامل التصحيح للبروتين النقي تكون أكثر من 1.7 وللأحماض النووية أقل من 0.5 .

3- طريقة بايوريت Biuret method

ان البروتينات التي تحوي على آصرة ببتيدية واحدة أو أكثر تعطي لون بنفسجي عند معاملته . مع محلول يحوي كبريتات النحاس في وسط قاعدي (مثل هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) واللون الذي يقاس عند الطول الموجي 570 نانوميتر ناتج من تكوين معقد بين أيون النحاسيك Cu|⁺⁺ مع أربعة ذرات نيتروجين، كل أثنين من أصرتين ببتيدية بين السلاسل الببتيدية كما في المعادلة الآتية (الشكل 24-6):

هناك بعض المركبات التي يمكن أن تتداخل مع تفاعل بايوريت مثل الأمونيا واليوريا اذ عند تفاعلهـا تعطي لون أزرق مع أيون النحاسيك Cut كما في المعادلة الآتية:

تستخدم طريقة بايوريت لتقدير محتوى البروتين عند تراكيز من 1 الى 20 ملغم ، لذلك تعد الطريقة ليست لها حساسية عالية لتقدير تراكيز قليلة.

4- طريقة لاوري المحورة  Modified Lowery method

وتسمى هذه الطريقة أيضاً بطريقة فولن - كيوكالتو    Folin- Ciocelteu وهي طريقة لونية محورة عن طريقة بايوريت في تقدير البروتين، اذ ينتج عنها تكوين لون أزرق يمتص عند الطول الموجي 750 نانوميتر وهذا اللون ناتج من مصدرين

 أ- تفاعل بايوريت مع البروتين وتكوين مركب النحاسيك كما في الطريقة السابقة.

ب اختزال محلول فوسفو مولبيديك تنكستيك من قبل وحدات التايروسين الموجود في البروتين كمـا في المعادلة أدناه:

ان هذا اللون الناتج عن التايروسين الموجود في البروتين والذي يقلل من استخدام هذه الطريقة لأن البروتينات تحتوي على كميات مختلفة من التايروسين ولا يمكن استخدامها لتقدير البروتينات عنـد وجــود مركبات فينولية أخرى في النموذج مع كون هذه الطريقة تعطي حساسية عالية لتقدير كميات ضئيلة مـــن البروتين التي تتراوح بين 25 - 500 مايكروغرام. هناك طرائق حديثة أخرى لتقدير كميات ضئيلة من البروتينات ومعظمها تعتمد على تكوين معقدات ملونة مع كواشف مختلفة عند طول موجي معين تستخدم في البحوث المتقدمة.

مواضيع ذات صلة

محلل الأحماض الأمينية التلقائي Automated amino acid analyzer

تقدير الوزن الجزيئي للبروتينات

استخلاص وتنقية البروتينات Isolation and purification of proteins

الكالموديولين Calmodulin

الكارنيتين Carnitine

حامض الليبويك Lipoic acid

حامض البانتوثينك Pantothenic acid

حامض الفوليك Folic acid (الفولاسين Folacin)

تراكيب الأحماض النووية

تغيير الحالة الطبيعية للبروتين (المسخ) Denaturation

ذوبانية البروتينات Solubility of proteins

بروتينات البلازما Plasma proteins