إتصل بنا

ENGLISH

بحث في العناوين     بحث في المحتوى     بحث في اسماء الكتب     بحث في اسماء المؤلفين

القرأن الكريم وعلومه
العقائد الأسلامية
الفقه الأسلامي
علم الرجال
السيرة النبوية
الاخلاق والادعية
اللغة العربية وعلومها
الأدب العربي
الأسرة والمجتمع
التاريخ
الأدارة والاقتصاد
علم الفيزياء
علم الكيمياء
علم الأحياء
الرياضيات
الزراعة
الجغرافية
القانون
الإعلام

رمز الامان : 9027

علم الكيمياء

عدد المواضيع في هذا القسم 7782
علم الكيمياء
الكيمياء التحليلية
الكيمياء الحياتية
الكيمياء العضوية
الكيمياء الفيزيائية
الكيمياء اللاعضوية
مواضيع اخرى في الكيمياء
الكيمياء الاشعاعية والنووية

خطوات تحديد تسلسل الاحماض الامينية (الترتيب الاولي) للببتيدات بطريقة (إدمان)

10:13 AM

4 / 5 / 2021

129

المؤلف : د. روبرت موراي وآخرون

المصدر : هاربرز في الكيمياء الحيوية

الجزء والصفحة : ص 124

+
-

خطوات تحديد تسلسل الاحماض الامينية (الترتيب الاولي) للببتيدات بطريقة (إدمان) :

بما أن العديد من البروتينات تتألف من أكثر من سلسلة ببتيدية مرتبطة بقوى غير تساهمية أو جسور ثنائية السلفيد، فإن فصل هذه السلاسل عن بعضها يجب أن يكون الخطوة الأولى باتجاه السلسلة. وتقوم العوامل الماسخة (كاليوريا وهيدروكلوريد الجوانيدين) بإزالة الروابط الهيدروجينية وفصل عديدات الببتيد المرتبطة بشكل غير تساهمي؛ أما العوامل المؤكسدة (Oxidizing) والمرجعة (المختزلة) (Reducing) فتقوم بكسر الروابط ثنائية السلفيد (الشكل 5-10). بعد ذلك، يتم فصل السلاسل الببتيدية بالاستشراب والرحلان الكهربي.

 

الشكل 5-10 : الانشطار التأكسدي  لسلاسل عديد: ل ببتبد مرتبطة بروابط ثنائية لسلفيد (الروابط المظللة) بحمض البيرفورميك (في الايسر. والتشطر الإختزالي ببيتا مركبتوايثانول (في الايمن) وهو يشكل نوعين من الببتيدات يتحد ان مع ثمالات حمض السستييك او السيستينيل على التريب.

تشطر عديدات الببتيدالكبيرة قبل إجراء سَّلسَلتِها

تكون أجهزة إجراء السلسلة الآلية للمسلسلات (Sequenators) أكثر كفاءة وعملية عندما يكون طول السلسلة الببتيدية بين 20 و 60 ثمالة, ولذلك فإن من المحبذ القيام بعمليات شطر نوعية في مواضع نادرة نسبياً، وتقوم الكواشف (Reagents) التالية بهذه الوظيفة:

أ - بروميد السيانوجين ( Cyanogen Brontide CNBR): يجري أولاً تحوير ثمالات السستيين بوساطة حمض  يودو. أسيتيك، ثم يقوم CNBr بالشطر في الجانب الكريوكسيلي (COOH) من الميثيونين. ويما أن الميثيونين نادرنسبياً في عديدات الببتيد. فإن استخدام CNBr يولد قطع (Fragments) ببتينية بأطوال مناسبة.

ب- الترييسين (Trypsin): يشطر التربنسين الببتيد عند الجانب الكربوكسيلي من الليسين والأرجينين. فإذا أجري لثمالات الليزيل Lysil اشتقاق بوساطة أنهيدريد السيتراكونيك (Citraconic anhydride) (وهو تفاعل عكسى) لتغيير شحنتها من الإيجابية إلى السلبية، فإن التريبسين يشطر فقط ما بعد الأرجينين. أما اشتقاق ثمالات الأرجينين فيكون أقل فائدة بسبب الغزارة النسبية في ثمالات الليسين. ومع ذلك، يفيد استعماله في شطر القطع الناجمة عن بروميد السيانوجين.

ج-O- يودوزوبنزين (O-Iodosobenzene): يشطر الروابط Trp-X النادرة نسبياً، ولا يحتاج عمله إلى أية حماية مسبقة لباقي الثمالات.

د - الهيدروكسيل أمين (Hydroxylamine): يشطر الروابط Asn-Gly النادرة نسبياً، ولكنه لا يعطي مردوداً من الناحية الكمية.

ه - البروتياز أو البروتيناز  ( Protease V8: V8 )وهو إنزيم مشتق من العنقودية الذهبية ( Staphylococcus aureus) ويقوم بشطر الببتيد عند الرابط Glu-X ويفضل المواقع التي يكون فيها X حمضاً أمينياً كارهاً للماء. ويقاوم الرابط Glu-Lys هذا الشطر مما يجعله مفيداً في شطر القطع الناجمة عن بروميد السيانوجين.

و-الحلمهة (التحلل المائي) الحمضية الخفيفة (Mild acid hydrolysis): تشطر الرابطة النادرة Asp-Pro.

تتطلب السلسلة عدة عمليات هضم:

يسمح إجراء هضم عديد الببتيد الأصلي لمرتين أو ثلاث (عادة يتم ذلك عند الميثيونين والتريبتوفان والأرجينين وبين الأسباراجين والجليسين) ثم الهضم الجزئي للقطع الناتجة، يسمح بتحديد البنية الأولية الكاملة لعديد الببتيد. وإذا حصلت صعوبات غير معتادة في تنقية القطع، فإن من الممكن تلافيها ببضع ميكرومولات من عديد الببتيد.

يجب فصل مزائج الببتيدات قبل سلسلتها :

تتم تنقية القطع بشكل أساسي بطريقة الترشيح الهلامي (Gel filtration) في حمض الأسيتيك أو حمض الفورميك، أو في الطور المعكوس لطريقة الاستشراب السائل رفيع الإنجاز (HPLC) أو بالاستشراب بتبادل الأيونات على الفسفوسلولوز أو السلفوفينيل سيفادكس (Sulfophenyl Sephadex) في محاليل من حمض الفسفوريك.

يمكن فصل الببتيدات بالاستشراب أو الرحلان الكهربي:

1  - الاستشراب بتبادل الأيونات والرحلان الكهربي عالي الفولطاج (HVE): تقوم هاتان التقنيتان على فصل المركبات اعتمادا على شحنتها، ويمكن تطبيقهما على عديدات الببتيد ذات الوزن الجزيئي المنخفض وعلى الأحماض الأمينية أيضاً. وتكون قيمة pK لزمرة الكربوكسيل - ألفا للحمض الأميني في النهاية الكربوكسيلية لعديد الببتيد أكبرمن تلك الخاصة بزمرة الكربوكسيل - ألفا في الحمض الأميني نفسه بشكله الحر (أي أن كربوكسيل الببتيد هي حمض أضعف). وعلى العكس من ذلك، فإن الزمرة الأمينية - ألفا للحمض الأميني في النهاية الأمينية تكون حمضاً أقوى (ولها pK أقل) من الزمرة الأمينية للحمض الأميني الحر الذي اشتقت منه.

2   — الترشيح الهلامي: يستخدم في طريقة السلسلة الآلية عدد قليل من الببتيدات الكبيرة (30-100 ثمالة). ومع ذلك، قد يكون العديد من عديدات الببتيد المتمسخة ذات الوزن الجزيئي العالي غير ذوابة بسبب ما يحدث خلال التمسخ من انكشاف للثمالات الكارهة للماء التي كانت مختبئة قبل ذلك. وفي حين يمكن التغلب على عدم الذوبان باستخدام اليوريا أو الكحولات أو الأحماض العضوية أو الأسس (القواعد)، فإن ذلك يحد من إمكانية الإستخدام اللاحق لتقنيات تبادل الأيونات في تنقية الببتيد.

يجرى الترشيح الهلامي لعديدات الببتيد الكارهة للماء في حمض الأسيتيك أو حمض الفورميك بتراكيز تتراوح بين 1و 4 مول/ليتر. وتقوم هذه التقنية بفصل الجزيئات ذات الأبعاد المختلفة اعتماداً على استبعادها أومرورها عبر ثقوب منخل جزيئي كالسيفادكس.

3  - الطور العكسى للاستشراب السائل عالي الاداء (HPLC): الطريقة الفعالة في تنقية الببتيدات غير القطبية عالية الوزن الجزيئي هي الاستشراب السائلي عالي الاداء على طور ثابت  (Support) غير قطبي، مع المزيح (Elution) بمذيبات قطبية (الطور المعكوس لتقنية HPLC) وتستعمل هذه التقنية مع تقنية الترشيح الهلامي لتنقية المزيج المعقد من الببتيدات الناجمة عن الهضم الجزئي للبروتينات.

4 - الترحيل الكهربي عالي الفولطاج (HVE) على المناخل الجزيئية Molecular sieves : قد يستخدم النخل الجزيئي بالتزامن مع الفصل اعتماداً على الشحنة لتسهيل عملية تنقية الببتيدات. وفي حين يمكن استعمال النشاء والأجاروز كدعام (طور ثابت)، فإن الأكثر شيوعاً هو استخدام المكثور المتصالب (متعدد او بوليمر متصالب) للأكريلاميد (البولي اكريلاميد) وفي حال استعمال الرحلان الكهربي على هلامة (جل) عديد الأكريلاميد (”PolyAcrylamide Gel Electrophoresis “PAGE)، تطبق محاليل البروتينات في الأنابيب المدروءة (محاليل منظم او بفر)  (Buffered) أوعلى ألواح (Slabs) من عديد الأكريلاميد المصالب (10-2 %) بإقحام ثنائي أكريلاميد الميثيلين (”Methylene bisacrylamide “bis) أو كواشف متصالبة أخرى مشابهة. بعد ذلك يتم تطبيق التيار المباشر. أما الإظهار فيتم بالتلوين بزرقة كوماسي (Coomassieblue) أو بأيونات الفضة (Ag+) . ولعل النمط الأكثر شيوعاً في هذا المجال هو استخدام تقنية PAGE في ظل ظروف ماسخة حيث يجري تسخين البروتين حتى الغليان وترحيله بوجود عامل ماسخ هو سلفات دوديسيل الصوديوم (SDS) وصيغته هي: --CH3 - (CH2)11 - SO3 يقوم هذا الأخير(وهوالمشحون سلبياً) بتشكيل غلاف  حول الببتيدات بما يعادل جزيئاً واحداً من SDS لكل رابطين ببتيديين تقريباً؛ وهذا «يقنع» (Swamps) او يلغي الشحنة الأصلية للبروتين ويصبح المركب الناتج سلبياً تماماً، وكنتيجة لذلك، تعتمد طرائق الفصل اللاحقة بشكل أساسي على مقاس او حجوم الجزيئات فقط. وتستخدم طريقة ٍSDS-PAGE بشكل واسع لتحديد الأوزان الجزيئية للبروتينات بمقارنة حركيتها مع حركية ببتيدات أخرى عيارية ذات أوزان جزيئية معروفة.

 

يستخدم تفاعل إدمان  في سلسلة الببتيد:

يستخدم كاشف إدمان (فينيل إيزو ثيوسيانات: Phenyl isothiocyanate) في إجراء السلسلة. وعلى غير ما هو الحال عليه في تقنية سانجر، فإن طريقة إدمان تبقي الببتيد المحور سليماً بعد نزع الحمض الأميني من النهاية الأمينية مما أحدث ثورة في مجال سلسلة البروتينات. ويقود تفاعل إدمان (الشكلأدناه) إلى تحرير الحمض الأميني من النهاية الأمينية للببتيد كمشتق للفينيل ثيوهيدانتوين، والذي يمكن تمييزه بعد ذلك بتقنية HPLC. ويجري للحمض الأميني التالي في الترتيب اشتقاق مماثل ثم يجري نزعه وتمييزه، وتكرر العملية بحيث يمكن تحديد تسلسل 4030 ثمالة حمض أميني (و 60-80 أحياناً) في عملية متواصلة واحدة. وتجري تفاعلات إدمان إما على فلم رقيق على جدار الحجرة الدوارة للتفاعل أو على مطرق (Matrix) صلب ربطت إليه النهاية الكربوكسيلية للببتيد برابط تساهمي. وأما طريقة السلسلة بالطور الغازي فتعتمد على كواشف غازية وتسهل نزع النواتج الغازية. وتطبق تقنية السلسلة بالطور السائل على الكميات الضئيلة جداً من الببتيدات (حتى 1 مكروجرام في بعض الحالات).

ثِـــــــمَارُ الأَسفَـــــــــار .. أَقَلُّ مَا يَلْزَمُكُمْ لله أَلاَّ تَسْتَعيِنُوا بِنِعَمِهِ عَلَى مَعَاصِيهِ

ثِـــــــمَارُ الأَسفَـــــــــار .. افْعَلُوا الْخَيْرَ وَلاَ تَحْقِرُوا مِنْهُ شَيْئاً

ثِـــــــمَارُ الأَسفَـــــــــار ..عقيدَتُنا في المَعادِ الجِسمانيِّ

ثِـــــــمَارُ الأَسفَـــــــــار .. أَفْضَلُ الزُّهْدِ إِخْفَاءُ الزُّهْدِ

مظاهر التطرف الاجتماعي

جدلية تأثُرْ النحو العربي بالمنطق والفلسفة

صندوق المستقبل

ثِـــــــمَارُ الأَسفَـــــــــار .. أَفْضَلُ الْأَعْمَالِ مَا أَكْرَهْتَ نَفْسَكَ عَلَيْهِ

أوغسطينوس العظيم .. الضال الذي أوصلته محطات الانحراف إلى الله!!

ما هو مقام المتقين يوم القيامة ؟

دعاءُ يوم الجمعة

دُعاء يوم الخميس

في معنى قوله تعالى { إِنَّمَا أَمْوَالُكُمْ وَأَوْلَادُكُمْ فِتْنَةٌ}

القصص القرآني خلاصة التجربة الإنسانية للسابقين

من الآراء الفقهية التي لا تمت الى العلم والتشريع بصلة!!

المريض بعين الله تعالى(من كرامة المؤمن على الله)

متى ترث البنت بالفرض وبالقرابة معاً ؟

الوراثة والبيئة وأثرهما على سعادة الفرد وشقائه

تدَخُّلُ الوالدينِ في الاختيارِ وتناقُضُ القناعاتِ

كيف َتكون علاقَتُكِ مع حَمَاتِكِ – أُمُّ زَوجِكِ – صافيةً ومُستَقِرَّةً؟

ماذا يجِبُ على مُعَلِّمَةِ الرَّوضَةِ أنْ تَعرِفَهُ؟

لماذا فُرِضَ الحِجابُ على المرأةِ؟

أدوارُ المرأةِ النّاجِحَة

ماهِيَ أُصولُ التربيةِ الإسلاميةِ؟

ماهِيَ أَهَمُّ مُشكِلَةٍ يواجِهُها الوالدانِ؟

حَفِّزْ طفلَكَ ليُبادِرَ الى اختيارِهِ

متى تكونُ الأسرَةُ مُنسَجِمةً؟

Civic الأسطورية من هوندا أصبحت أكبر وأكثر جاذبية!

Amazon توسّع منافستها لآبل بأجهزة ذكية مميّزة

ثغرة في شرائح Qualcomm تهدد هواتف أندرويد حول العالم!

قشور البرتقال للحصول على خشب شفاف

العثور على جمجمة لثور قديم عمره 10 آلاف عام جنوب سيبيريا

باحثون يرصدون تفاعلات نووية جديدة في تابوت مفاعل تشيرنوبيل ويحذرون من كارثة

مركبة أخرى من هيونداي لمحبي التميّز والقوة والتصاميم العصرية

تويوتا تعلن عن أحدث سياراتها العائلية الأنيقة والعملية

ميزة طال انتظارها ستظهر في تليغرام قريبا

اكتشافها قد ينقذ حياتك .. قائمة كاملة بأعراض النوبة القلبية ينبغي أن تكون على دراية بها!

تقوي المناعة وتقي من الأمراض... 10 أطعمة احرص عليها في سن الأربعين

يمكنك تناول هذه الأطعمة في الليل دون ضرر

خبراء: ماذا يحدث لجسمك إذا تناولت المعكرونة يوميا؟

كيف يؤثر عدم تناول الفطور على الصحة

أخصائية روسية تكشف عن الأشخاص الممنوعين من تناول البصل

عشق القهوة قد تحكمه عوامل جينية

فوائد تناول التمر بانتظام

طبيبة روسية تكشف عن المواد الغذائية المساعدة للهضم

زكاةُ الفطرة: مقدارُها.. ولمَنْ تُعطى.. بحسب مكتب المرجع الدينيّ الأعلى

مزارُ السيدة زينب الصغرى أحد المحطّات الرمضانيّة لقسم الشؤون الدينيّة

العتبة العلوية توزع وجبات الإفطار للمصابين بوباء كورونا والعاملين على رعايتهم

مركز القرآن الكريم في العتبة العلوية يقيم ندوة علمية بعنوان (مصحف جامعة كامبريدج رقم (1125) - دراسة تحليلية)

بالصور: التائبون العابدون الساجدون.. أجواء ايمانية خاصة عند مرقد الامام الحسين (ع) خلال شهر رمضان

بهدف توفير الخدمات والراحة النفسية للمواطنين والزائرين.. كوادر العتبة الحسينية تباشر بتأهيل أحد اهم الشوارع المؤدية الى مرقد الامام الحسين (ع)

الأمانة العامة للعتبة الكاظمية المقدسة تباشر بمشروع مظلات صحن باب المراد

وفد معهد القرآن الكريم في العتبة العباسية المقدسة يشارك في المحفل القرآني الرمضاني للعتبة الكاظمية المقدسة

العتبة العسكرية المقدسة توزع وجبة جديدة من السلات الغذائية الرمضانية للعوائل المتعففة من أهالي سامراء