خطوات تحديد تسلسل الاحماض الامينية (الترتيب الاولي) للببتيدات بطريقة (إدمان) :

بما أن العديد من البروتينات تتألف من أكثر من سلسلة ببتيدية مرتبطة بقوى غير تساهمية أو جسور ثنائية السلفيد، فإن فصل هذه السلاسل عن بعضها يجب أن يكون الخطوة الأولى باتجاه السلسلة. وتقوم العوامل الماسخة (كاليوريا وهيدروكلوريد الجوانيدين) بإزالة الروابط الهيدروجينية وفصل عديدات الببتيد المرتبطة بشكل غير تساهمي؛ أما العوامل المؤكسدة (Oxidizing) والمرجعة (المختزلة) (Reducing) فتقوم بكسر الروابط ثنائية السلفيد (الشكل 5-10). بعد ذلك، يتم فصل السلاسل الببتيدية بالاستشراب والرحلان الكهربي.

الشكل 5-10 : الانشطار التأكسدي  لسلاسل عديد: ل ببتبد مرتبطة بروابط ثنائية لسلفيد (الروابط المظللة) بحمض البيرفورميك (في الايسر. والتشطر الإختزالي ببيتا مركبتوايثانول (في الايمن) وهو يشكل نوعين من الببتيدات يتحد ان مع ثمالات حمض السستييك او السيستينيل على التريب.

تشطر عديدات الببتيدالكبيرة قبل إجراء سَّلسَلتِها

تكون أجهزة إجراء السلسلة الآلية للمسلسلات (Sequenators) أكثر كفاءة وعملية عندما يكون طول السلسلة الببتيدية بين 20 و 60 ثمالة, ولذلك فإن من المحبذ القيام بعمليات شطر نوعية في مواضع نادرة نسبياً، وتقوم الكواشف (Reagents) التالية بهذه الوظيفة:

أ - بروميد السيانوجين ( Cyanogen Brontide CNBR): يجري أولاً تحوير ثمالات السستيين بوساطة حمض  يودو. أسيتيك، ثم يقوم CNBr بالشطر في الجانب الكريوكسيلي (COOH) من الميثيونين. ويما أن الميثيونين نادرنسبياً في عديدات الببتيد. فإن استخدام CNBr يولد قطع (Fragments) ببتينية بأطوال مناسبة.

ب- الترييسين (Trypsin): يشطر التربنسين الببتيد عند الجانب الكربوكسيلي من الليسين والأرجينين. فإذا أجري لثمالات الليزيل Lysil اشتقاق بوساطة أنهيدريد السيتراكونيك (Citraconic anhydride) (وهو تفاعل عكسى) لتغيير شحنتها من الإيجابية إلى السلبية، فإن التريبسين يشطر فقط ما بعد الأرجينين. أما اشتقاق ثمالات الأرجينين فيكون أقل فائدة بسبب الغزارة النسبية في ثمالات الليسين. ومع ذلك، يفيد استعماله في شطر القطع الناجمة عن بروميد السيانوجين.

ج-O- يودوزوبنزين (O-Iodosobenzene): يشطر الروابط Trp-X النادرة نسبياً، ولا يحتاج عمله إلى أية حماية مسبقة لباقي الثمالات.

د - الهيدروكسيل أمين (Hydroxylamine): يشطر الروابط Asn-Gly النادرة نسبياً، ولكنه لا يعطي مردوداً من الناحية الكمية.

ه - البروتياز أو البروتيناز  ( Protease V8: V8 )وهو إنزيم مشتق من العنقودية الذهبية ( Staphylococcus aureus) ويقوم بشطر الببتيد عند الرابط Glu-X ويفضل المواقع التي يكون فيها X حمضاً أمينياً كارهاً للماء. ويقاوم الرابط Glu-Lys هذا الشطر مما يجعله مفيداً في شطر القطع الناجمة عن بروميد السيانوجين.

و-الحلمهة (التحلل المائي) الحمضية الخفيفة (Mild acid hydrolysis): تشطر الرابطة النادرة Asp-Pro.

تتطلب السلسلة عدة عمليات هضم:

يسمح إجراء هضم عديد الببتيد الأصلي لمرتين أو ثلاث (عادة يتم ذلك عند الميثيونين والتريبتوفان والأرجينين وبين الأسباراجين والجليسين) ثم الهضم الجزئي للقطع الناتجة، يسمح بتحديد البنية الأولية الكاملة لعديد الببتيد. وإذا حصلت صعوبات غير معتادة في تنقية القطع، فإن من الممكن تلافيها ببضع ميكرومولات من عديد الببتيد.

يجب فصل مزائج الببتيدات قبل سلسلتها :

تتم تنقية القطع بشكل أساسي بطريقة الترشيح الهلامي (Gel filtration) في حمض الأسيتيك أو حمض الفورميك، أو في الطور المعكوس لطريقة الاستشراب السائل رفيع الإنجاز (HPLC) أو بالاستشراب بتبادل الأيونات على الفسفوسلولوز أو السلفوفينيل سيفادكس (Sulfophenyl Sephadex) في محاليل من حمض الفسفوريك.

يمكن فصل الببتيدات بالاستشراب أو الرحلان الكهربي:

1  - الاستشراب بتبادل الأيونات والرحلان الكهربي عالي الفولطاج (HVE): تقوم هاتان التقنيتان على فصل المركبات اعتمادا على شحنتها، ويمكن تطبيقهما على عديدات الببتيد ذات الوزن الجزيئي المنخفض وعلى الأحماض الأمينية أيضاً. وتكون قيمة pK لزمرة الكربوكسيل - ألفا للحمض الأميني في النهاية الكربوكسيلية لعديد الببتيد أكبرمن تلك الخاصة بزمرة الكربوكسيل - ألفا في الحمض الأميني نفسه بشكله الحر (أي أن كربوكسيل الببتيد هي حمض أضعف). وعلى العكس من ذلك، فإن الزمرة الأمينية - ألفا للحمض الأميني في النهاية الأمينية تكون حمضاً أقوى (ولها pK أقل) من الزمرة الأمينية للحمض الأميني الحر الذي اشتقت منه.

2   — الترشيح الهلامي: يستخدم في طريقة السلسلة الآلية عدد قليل من الببتيدات الكبيرة (30-100 ثمالة). ومع ذلك، قد يكون العديد من عديدات الببتيد المتمسخة ذات الوزن الجزيئي العالي غير ذوابة بسبب ما يحدث خلال التمسخ من انكشاف للثمالات الكارهة للماء التي كانت مختبئة قبل ذلك. وفي حين يمكن التغلب على عدم الذوبان باستخدام اليوريا أو الكحولات أو الأحماض العضوية أو الأسس (القواعد)، فإن ذلك يحد من إمكانية الإستخدام اللاحق لتقنيات تبادل الأيونات في تنقية الببتيد.

يجرى الترشيح الهلامي لعديدات الببتيد الكارهة للماء في حمض الأسيتيك أو حمض الفورميك بتراكيز تتراوح بين 1و 4 مول/ليتر. وتقوم هذه التقنية بفصل الجزيئات ذات الأبعاد المختلفة اعتماداً على استبعادها أومرورها عبر ثقوب منخل جزيئي كالسيفادكس.

3  - الطور العكسى للاستشراب السائل عالي الاداء (HPLC): الطريقة الفعالة في تنقية الببتيدات غير القطبية عالية الوزن الجزيئي هي الاستشراب السائلي عالي الاداء على طور ثابت  (Support) غير قطبي، مع المزيح (Elution) بمذيبات قطبية (الطور المعكوس لتقنية HPLC) وتستعمل هذه التقنية مع تقنية الترشيح الهلامي لتنقية المزيج المعقد من الببتيدات الناجمة عن الهضم الجزئي للبروتينات.

4 - الترحيل الكهربي عالي الفولطاج (HVE) على المناخل الجزيئية Molecular sieves : قد يستخدم النخل الجزيئي بالتزامن مع الفصل اعتماداً على الشحنة لتسهيل عملية تنقية الببتيدات. وفي حين يمكن استعمال النشاء والأجاروز كدعام (طور ثابت)، فإن الأكثر شيوعاً هو استخدام المكثور المتصالب (متعدد او بوليمر متصالب) للأكريلاميد (البولي اكريلاميد) وفي حال استعمال الرحلان الكهربي على هلامة (جل) عديد الأكريلاميد (”PolyAcrylamide Gel Electrophoresis “PAGE)، تطبق محاليل البروتينات في الأنابيب المدروءة (محاليل منظم او بفر)  (Buffered) أوعلى ألواح (Slabs) من عديد الأكريلاميد المصالب (10-2 %) بإقحام ثنائي أكريلاميد الميثيلين (”Methylene bisacrylamide “bis) أو كواشف متصالبة أخرى مشابهة. بعد ذلك يتم تطبيق التيار المباشر. أما الإظهار فيتم بالتلوين بزرقة كوماسي (Coomassieblue) أو بأيونات الفضة (Ag+) . ولعل النمط الأكثر شيوعاً في هذا المجال هو استخدام تقنية PAGE في ظل ظروف ماسخة حيث يجري تسخين البروتين حتى الغليان وترحيله بوجود عامل ماسخ هو سلفات دوديسيل الصوديوم (SDS) وصيغته هي: ^--CH₃ - (CH₂)₁₁ - SO₃ يقوم هذا الأخير(وهوالمشحون سلبياً) بتشكيل غلاف  حول الببتيدات بما يعادل جزيئاً واحداً من SDS لكل رابطين ببتيديين تقريباً؛ وهذا «يقنع» (Swamps) او يلغي الشحنة الأصلية للبروتين ويصبح المركب الناتج سلبياً تماماً، وكنتيجة لذلك، تعتمد طرائق الفصل اللاحقة بشكل أساسي على مقاس او حجوم الجزيئات فقط. وتستخدم طريقة ٍSDS-PAGE بشكل واسع لتحديد الأوزان الجزيئية للبروتينات بمقارنة حركيتها مع حركية ببتيدات أخرى عيارية ذات أوزان جزيئية معروفة.

يستخدم تفاعل إدمان  في سلسلة الببتيد:

يستخدم كاشف إدمان (فينيل إيزو ثيوسيانات: Phenyl isothiocyanate) في إجراء السلسلة. وعلى غير ما هو الحال عليه في تقنية سانجر، فإن طريقة إدمان تبقي الببتيد المحور سليماً بعد نزع الحمض الأميني من النهاية الأمينية مما أحدث ثورة في مجال سلسلة البروتينات. ويقود تفاعل إدمان (الشكلأدناه) إلى تحرير الحمض الأميني من النهاية الأمينية للببتيد كمشتق للفينيل ثيوهيدانتوين، والذي يمكن تمييزه بعد ذلك بتقنية HPLC. ويجري للحمض الأميني التالي في الترتيب اشتقاق مماثل ثم يجري نزعه وتمييزه، وتكرر العملية بحيث يمكن تحديد تسلسل 4030 ثمالة حمض أميني (و 60-80 أحياناً) في عملية متواصلة واحدة. وتجري تفاعلات إدمان إما على فلم رقيق على جدار الحجرة الدوارة للتفاعل أو على مطرق (Matrix) صلب ربطت إليه النهاية الكربوكسيلية للببتيد برابط تساهمي. وأما طريقة السلسلة بالطور الغازي فتعتمد على كواشف غازية وتسهل نزع النواتج الغازية. وتطبق تقنية السلسلة بالطور السائل على الكميات الضئيلة جداً من الببتيدات (حتى 1 مكروجرام في بعض الحالات).

مواضيع ذات صلة

محلل الأحماض الأمينية التلقائي Automated amino acid analyzer

تقدير الوزن الجزيئي للبروتينات

استخلاص وتنقية البروتينات Isolation and purification of proteins

الكالموديولين Calmodulin

الكارنيتين Carnitine

حامض الليبويك Lipoic acid

حامض البانتوثينك Pantothenic acid

حامض الفوليك Folic acid (الفولاسين Folacin)

تراكيب الأحماض النووية

تقدير البروتين Protein determination

تغيير الحالة الطبيعية للبروتين (المسخ) Denaturation

ذوبانية البروتينات Solubility of proteins