الأسلوب المتبع حاليا لسلسلة البروتين

يتطلب تنسيل (Cloning) الجين وجود قلائل نوكليوتيدات (Oligonucleotides) اصطناعية مؤلفة من 19 مونومر (Monomers) أو أكثر وترمز لتسلسلات نوعية من الأحماض الأمينية في البروتين المستهدف . ويتطلب تصميم قلائل النوكليوتيدات (اوليكونيكليوتيد) هذه وجود معلومات عن سلاسل الأحماض الأمينية الجزئية التي يمكن الحصول عليها من كميات صغيرة نوعاً ما من البروتين. وللحصول على هذه المعلومات، يمكننا استخدام مسلسلات البروتين (Protein sequenators) ومقياس طيف الكتلة التي تستطيع سلسلة حتى بيكومول واحد (10^-12 مول) من البروتين؛ فبالنسبة إلى ببتيد وزنه الجزيئي 5000، يساوي 1 بيكومول منه 50 نانوجرام فقط (أي 50× ^9-10  جرام). وتتطلب هذه الكميات الصغيرة عناية فائقة في النقل [الإيداء (Handling. لأنها تلتصق بمعظم السطوح حتى التيفلون، ونستخدم في التنقية أعمدة الاستشراب التي تحتوي على 1 مل أو أقل من مادة الحشو؛ ونتجنب الديال (الديلزة) لتبادل الدوارئ لأن أغشية الديال تربط البروتين. كما تستخدم خطة التنقية شحنة ومادة كارهة للماء ومنخلاً للجزيئات مما يسمح بثلاث عمليات فصل متعاقبة وتتجنب التركيز أو الديال (الديلزة). وتطبق العينة على عمود مبادل للأيونات. وبعد الشطف، يضاف الملح إلى الأجزاء الفاعلة للسماح بالتصاق البروتين مع داعم التآثر الكاره للماء في العمود الثاني. وبعد ذلك، تخضع الأجزاء الفاعلة من هذا العمود إلى الاستشراب الاستبعادي الحجمي (حسب الحجم) Size-exclusion chromatography. وعند توافر كميات بالنانومول من البروتين المتجانس، تستخدم الإجراءات المذكورة لاحقاً لتعيين البنية الأولية، بإشراك تكنولوجيا سلسلة الدنا (DNA) والبروتين. ويرشد تركيب الأحماض الأمينية في البروتين نحو اختيار الطريقة التي تشطره إلى ببتيدات تحتوي على 25-50 ثمالة حمض أميني؛ فإذا كان تركيب الأحماض الأمينية غير معروف، يشطر 1 نانومول من البروتين عند ثمالات الليسيل أو الجلوتاميل (الجدول 5-2)؛ ثم تفصل الببتيدات الناتجة بطريقة (HPLC) بالطور المعكوس. وتكشف الببتيدات الناشئة اعتماداً على قدرة الرابط الببتيدي على امتصاص الضوء فوق البنفسجي بطول 220-230 نانومتر. وبعد ذلك تجري سلسلة المادة في كافة الذرى المتناظرة بطريقة «إدمان»، وتؤمن الذرى التي تحتوي على ببتيدات منفردة معلومات مناسبة عن نموذج مسابير (Probes) قليلة النوكليوتيدات لاختيار نسائل الدنا المتمم [ [(Complementary DNA (cDNA من مكتبة الدنا المتمم cDNA)] ؛ ثم تجري سلسلة الدنا المتمم (cDNA) - (انظر الفصل 42).

تخضع بروتينات حقيقيات النوى عادة لعمليات الحلمهة (التحلل المائي) أو للتحوير بعد الترجمة (كإضافة الجليكوزيل أو الميثيل أو الفسفرة) والتي لا يمكن لتقنية سلسلة الدنا (DNA) أن تظهرها. ولكشف هذه التغيرات، يجري شطر نحو 1 نم من البروتين إلى شدف ببتيدية بطول 5-50 ثمالة. ويكشف الشطر بين ثمالات السيستيين الببتيدات المرتبطة بروابطثنائية السلفيد. وبعد فصل الشدف الناتجة بواسطة HPLC ، تحلل الأجزاء الذروية بمقياس الطيف الكتلوي بقذف الذرات السريع (FAB-MS) وتؤدي مقارنة الأوزان الجزيئية الذرية الكتلية الملاحظة للببتيد مع تلك التي يتنبأ بها من السلسلة إلى إعطاء مفاتيح نحو معرفة أنواع التحوير بعد الترجمة المحتملة.

الجدول 5-2 : نوعية بعض طرائق الشطر الإنزيمية المختارة.

مواضيع ذات صلة

محلل الأحماض الأمينية التلقائي Automated amino acid analyzer

تقدير الوزن الجزيئي للبروتينات

استخلاص وتنقية البروتينات Isolation and purification of proteins

الكالموديولين Calmodulin

الكارنيتين Carnitine

حامض الليبويك Lipoic acid

حامض البانتوثينك Pantothenic acid

حامض الفوليك Folic acid (الفولاسين Folacin)

تراكيب الأحماض النووية

تقدير البروتين Protein determination

تغيير الحالة الطبيعية للبروتين (المسخ) Denaturation

ذوبانية البروتينات Solubility of proteins