تقدير المركبات الغذائية في مواد العلف

تقدير الاحماض الامينية في مواد العلف بطريقة الفصل الكروماتوجرافي على الأعمدة باستعمال جهاز Column Chromatography Amino Acid Analyzer

تقدر الأحماض الأمينية في أي بروتين بأن تحلل المادة الغذائية تحليلاً مائياً hydrolysis حتى تنفرد الأحماض الأمينية من روابطها ثم يبدأ التقدير بإحدى الطرائق المتعددة للتقدير. وسنكتفي هنا بشرح طريقة الفصل الكرومتوجرافي على الأعمدة.

تعد هذه الطريقة التي قدمها 1948 Stein Moore وطرأ عليها شيء من التغيير بعد ذلك بوساطة 1958 Spackman, Stein Moore من أدق الطرق في فصل الأحماض الأمينية – وتعتمد طرائق الفصل الكروماتوجرافي عامة على استخدام مواد صلبة ادمصاصية تتمتع بقدرة خاصة لادمصاص بعض المواد. إذ تدخل هذه المواد في صورة ذائبة وبعد ادمصاصها يضاف محلول آخر يمكن أن يحرر (elute) مادة أو أكثر من الخليط الذي تم ادمصاصه ويذيبها. وطريقة الفصل الكرومانجرافي على الأعمدة تعتمد علي:

آ) خاصية أن الأحماض الأمينية تختلف في سرعة الادمصاص ودرجاته على حبيبات مادة الريزين Resins.

ب) تعتمد قوة الادمصاص والغسيل على درجة الحموضة pH.

وتستخدم مادة الريزين Resins وهى مادة صلبة ذات حبيبات كروية دقيقة بأقطار معينة (10 مكرون) في عمود أو عمودين (حسب نوع الجهاز) بأطوال وأقطار مختلفة – إذ يضاف مخلوط الأحماض الأمينية المذاب في محلول منظم (Buffer) غالباً ذي ph حامضية (Ph2) والذي يجعل الاحماض الامينية تدمص على الريزين ثم تحرر (elute) الاحماض الامينية من الريزين باستخدام محاليل متدرجة في الph وهي غالبا 3 انواع من ال Buffers المختلفة في الدرجة ال: PH 525. PH325 PH425 ثم تدخل الاحماض الامينية الذائبة في هذه المحاليل المنظمة Buffers في نظام خاص مستمر حسب نوع الجهاز لتقدير كمية كل حامض اميني ويعتمد ذلك على التفاعل بين الاحماض الامينية والـ Ninhydrin وقياس اللون الناتج عن التفاعل بجهاز Colorimeter وتسجيل النتائج على جهاز مسجل Recorder.

ولحساب الأحماض الأمينية لأي بروتين يستعمل محلول قياسي Standard مكون من كميات معلومة من الأحماض الأمينية المختلفة مضافاً إليه الكمية المعلومة أيضاً من الحمض الاميني الصناعي Nor-leucine ويجري له نفسه التحليل علي الجهاز ويقارن بالعينة المختبرة غير المعروف محتواها من الأحماض الأمينية والمضاف إليها الكمية ذاتها من ال Nor- leucineكحامض قياسي داخلي internal Standard.

ومن العلاقة بين ارتفاع ال  peaksللحامض الاميني ولل Nor- leucine في العينة المختبرة وما يقابلهم في الـ Standard يمكن حساب كمية الحامض الأميني الموجود في العينة.

وحديثاً امكن توصيل المسجل Recorder بجهاز حاسوبي Computer يقوم مباشرة بعمليات الحساب وتسجيل كميات الأحماض الأمينية المختلفة المغسولية من العينة المختبرة.

ويمكن تلخيص خطوات العمل لتقدير الأحماض الأمينية في الآتي:

* يؤخذ بدقة زنة من العينة بحيث تحتوي على حوالي 10 ميللجرام نيتروجين وتنقل إلى دورق مستدير سعة 500 مل.

* يضاف إلى العينة 240 مللي من حامض كلور الماء ٦ عياري (6N Hcl).

* يوضع الدورق في جهاز التحليل المائي Under a reflux condenser ويمرر غاز النيتروجين خلال المحلول داخل الدورق لمدة حوالي 30 دقيقة قبل ابتداء التسخين.

* تستمر عملية التسخين والتحليل المائي لمدة 20 ساعة على درجة حرارة 110 م تحت مرور النيتروجين.

* بعد انتهاء المدة المقررة للتحليل المائي توقف عملية التسخين ويترك الدورق حتى يارد.

* يرشح المحلول (hydrolysate) خلال دورق ترشيح ويكمل ال حجم 500 مللي بوساطة ماء مقطر.

* يؤخذ حجم معلوم من المحلول ويجرى له عملية تبخير حتى الجفاف على درجة حرارة 40 م تحت ضغط Under reduced pressure باستعمال جهاز خاص ويغسل بالماء المقطر مرتين ويجفف.

* تذاب العينة المجففة بعد ذلك في حجم معلوم من pH 2.0 Buffer ويحتوي على كمية معلومة من الـ Nor-leucine وتحفظ في زجاجات صغيرة مغلقلة.

* وبذلك تكون العينة جاهزة لتحليلات جهاز Amino Acid Analyzer فتحلل على الجهاز وفي الوقت نفسه تحلل عينة Stundard Amino Acid Mixture المحتوي على نفس كمية الNor- leucine .

• تجري الحسابات التقدير كمية علي حامض اميني.