طرق الاليزا لتشخيص الفايروسات النباتية

الاليزا Elisa هو مصطلح مشتقة كلماته من الأحرف الأولى للطريقة المصلية "اختبار المناعة الامتصاصية المرتبطة بالإنزيم "Enzyme Linked Immunosorbent Assay التي ابتكرها Clark و Adams ((1977 والتي أحدثت ثورة في تشخيص الفايروسات عموما ومنها الفايروسات النباتية، فهي طريقة عالية الكفاءة في الكشف عن الفايروسات بسبب حساسيتها العالية اذ يمكنها الكشف عن تراكيز منخفضة جدا للفايروس تصل الى 1-10 نانوغرام / مل عصير نباتي كما أنها سهلة التطبيق واقتصادية وتتيح إمكانية فحص عدد كبير من العينات في وقت واحد وهي تعتمد في الكشف عن الفايروسات على إحداث تغيير لوني بسبب التفاعل المصلي بين الفايروس والأضداد المرتبطة بإنزيم الفوسفاتيز الذي يغير لون المادة الأساس التي يعمل عليها فيظهر اللون الأصفر الذي يدل على وجود الفايروس في العينة المختبرة، توجد عدة طرق من الاليزا حيث جرى تطوير على الطريقة التقليدية وهي طريقة الأليزا المباشرة وفيما يأتي وصف لهذه الطرق.

أ- طريقة الاليزا المباشرة

طريقة الاليزا المباشرة Direct Double Antibody Sandwich-ELISA وتسمى اختصارا DAS-ELISA هي الطريقة الأساسية التي ابتكرها Clark و Adams ( (1977ويستعمل فيها طبق من البوليسترين Polystyrene microtiter plate المكون من 96 حفرة والذي يمتاز بخاصيته في ادمصاص البروتين حيث يمثل الطبق الطور الصلب من التفاعل Solid phase فيما تكون بقية مواد التفاعل سائلة، يلخص الشكل (1) خطوات هذه الطريقة.

الشكل (1): طريقة الاليزا المباشرة DAS- Elisa

يبين الشكل الخطوات الأربع الأساسية للطريقة والتي تتكرر في كل حفرة في طبق البوليسترين المكون من 96 حفرة وكما يأتي: الخطوة (1) إضافة محلول الضد lgG إلى الحفرة لترتبط جزيئاته بقعرها ثم تغسل الحفرة. الخطوة (2) إضافة العينة (عصير النبات المصاب) فترتبط جسيمة الفايروس مع جزيئة الضد ثم تغسل الحفرة. الخطوة (3) إضافة محلول المترابط Conjugate وهو عبارة عن جزيئة الضد IgG والمرتبط من نهايته الثابتة (FC) مع إنزيم الفوسفاتيز القاعدي Alkaline phosphatase، ويكرر غسل الحفرة. الخطوة (4) إضافة المادة الأساس عديمة اللون إلى الحفر وهي مركب فوسفات البارانايتروفينيل" P-mitrophenyl phosphate التي رمز لها بالكرات البيضاء، حيث سيعمل عليها الأنزيم ويحولها إلى اللون الأصفر (الكرات السوداء) بسبب سحب الفوسفات منها ويشاهد هذا اللون بصريا وظهوره دليل وجود الفايروس أو يقرأ امتصاصه طيفيا عند الطول الموجي 405 نانوميتر.

الشكل مقتبس منCann  (2005).

ب- طريقة الاليزا الثلاثية

طريقة الاليزا الثلاثية Triple antibody Sandwich-ELISA والتي تعرف اختصارا TAS-ELISA كما تسمى أيضا الاليزا غير المباشرة Indirect ELISA هي تطوير للطريقة السابقة باستعمال "المترابط" Conjugate المكون من الإنزيم المرتبط مع جلوبيولين الماعز المضاد للأضداد المنتجة في الأرانب Goat antirabbit globulin حيث يحقن الماعز بالجزء الثابت (FC) الأضداد الأرانب ثم تربط أضداد الماعز مع الإنزيم لتكوين "المترابط"، وبذلك أضيفت خطوة لاختبار الاليزا المباشرة وهي ارتباط المترابط مع ضد الأرنب وليس مع الفايروس كما في الاليزا المباشرة ولذلك سميت بالطريقة غير المباشرة، (الشكل 2) تكشف هذه الطريقة عن مدى واسع من سلالات النوع الفايروسي المراد تشخيصه باستعمال نفس المصل المضاد وذلك بسبب قدرة التفاعل المصلي لأضداد الأرنب مع عدد واسع من "المترابطات"، وعليه فان هذه الطريقة تجاوزت مشكلة عدم القدرة على الكشف عن السلالات غير المتخصص عليها الإنزيم في اختبار الاليزا المباشرة لذا فهي الطريقة الأصلح للكشف عن الفايروسات المتقاربة مصليا باستعمال أطباق البوليسترين غير مغلفة مسبقا بالأضداد Unpre-coated plates لان هذا الإجراء سيلغي احتمال التداخل غير المرغوب فيه مع عصير النبات الخام المصاب إذا ما استعملت أطباق غير مغلفة. ورغم ذلك تبقى طريقة الاليزا المباشرة هي الأفضل في الكشف الروتيني عن فايروسات النبات في الحالات التي لا تظهر فيها مشكلة تخصصية السلالة أو التركيز المنخفض جدا للفايروس في النسيج النباتي. يمكن استبدال إنزيم الفوسفاتيز القاعدي بإنزيم Horseradish peroxidase إلا أن هذا الأخير لا يفضل استعماله مع عصير جذور النباتات العشبية لاحتوائها على مركبات تتفاعل مع هذا الانزيم مما يربك النتائج.

الشكل (2): طريقة الاليزا الثلاثية TAS-ELISA. تنجز الطريقة وفق الخطوات التالية: (1) إضافة محلول الضد IgG المنتج في الأرنب إلى الحفرة لتدمص جزيئاته بقعرها (2) إضافة الفايروس (3) إضافة ثانية لمحلول الضد IgG المنتج في الأرنب إلى الحفرة لترتبط جزيئاته مع الفايروس (4) إضافة المترابط وهو محلول أضداد الماعز المنتجة ضد أضداد الارنب المرتبطة بالانزيم Enzyme labeled goat anti rabbit IgG)) (5) إضافة المادة الأساس.

الشكل مقتبس من Anon ( (1994.

ج- طريقة البنيسيلينيز- إليزا

طريقة البنيسيلينيز – إليزا Penicillinase-ELISA هي تطوير لطريقة الاليزا الثلاثية حيث استبدل إنزيم الفوسفاتيز القاعدي بإنزيم البنيسيلينيز في "المترابط" وذلك لرخص ثمنه وكفاءته في إنتاج اللون حيث يعمل هذا الإنزيم على المادة الأساس المتكونة من مادتيBromothymol blue , BTB , Bromocresol purple , BCP بنفسجيا مزرقا أو أصفرا غامقا بعد تفاعلها مع الإنزيم.

د - طريقة الاليزا التضخمية

طريقة الاليزا التضخمية Amplification-ELISA هي طريقة مطورة لطريقة الاليزا المباشرة لزيادة حساسيتها في الكشف عن الفايروسات عند وجودها بتركيز منخفض جدا في النباتات لا تتحسسه الطريق المباشرة وذلك بالسماح أولا لجزيئة إنزيم الفوسفاتيز القاعدي أولا في البدء بدورة تفاعلات تسلسلية قادرة على إنتاج 100 -1000 ضعف من النتاج اللوني البنفسجي أي زيادة الكثافة اللونية التفاعلية، (الشكل 3) ولكن من سلبيات هذه الطريقة هي أنها باهظة التكاليف بسبب ارتفاع ثمن المركبات المستعملة.

الشكل (3): مخطط طريقة الاليزا التضخمية. يبدأ إنزيم الفوسفاتيز القاعدي بدورة تفاعلية بتحويل المركب NADP إلى المركب NAD الذي يختزل الايثانول إلى مركب الأسيتيل الديهايد (الجزء الأيمن من الدورة التفاعلية) مما يؤدي إلى تحويل المركب البنفسجي INT - Violet إلى مركب الفورمازون البنفسجي اللون (الجزء الأيسر من الدورة التفاعلية).

الشكل مقتبس من Van den Heuvel و Peters (1989).

ه- الاليزا البقعية النسيجية (البصمة المناعية)

الاليزا البقعية النسيجية  Dot – ELISAأو البصمة المناعية Immunoblot والتي تسمى أيضا طريقة الربط المناعي البصمي البقعي" Dot blot immunobinding هي مجموعة تقانات تمثل تطوير الطرق الاليزا باستبدال طبق البوليسترين بأشرطة النايتروسيليلوز Nitrocellulose membrane الذي يعرف اختصارا NCM أو النايلون Nylon membrane حيث يمتلك الشريط نفس خاصية الطبق وهي ادمصاص البروتينات وقد أدى هذا الاستبدال إلى تسهيل طريقة الفحص وجعلها أكثر ملائمة للكشف الحقلي الواسع المدى عن الفايروسات، تتم الطريقة بادمصاص الفايروس مباشرة على الشريط وذلك ببصم السطح النباتي المصاب المقطوع حديثا على الشريط ثم معاملته بمحلول الأضداد الأولية المتخصصة Virus Specific antibodies ثم إضافة المترابط الإنزيمي المكون من الإنزيم المرتبط مع الأضداد الثانوية يعقب ذلك إضافة المادة الأساس التي يتغير لونها وتسبب ظهور مساحات لونية بنفسجية مزرقة على الشريط في حالة وجود الفايروس. تضم الاليزا البقعية ثلاثة أنواع رئيسية هي:

1- طريقة بصمة النسيج المناعية Tissue blot immunoassay (TBIA)

يتم في هذه الطريقة بصم شريط النايتروسيليلوز مباشرة بالفايروس وذلك بعمل قطع حاد في سيقان البادرات أو أعناق الأوراق أو الأوراق المصابة وبصم الجزء المقطوع على الشريط الذي يمتص جزء من العصير النباتي الحامل للفايروس، ثم يعامل الشريط بالمحلول المنظم الغالق البروتيني Protein blocking Solution والذي يحضر من الحليب المقشود المزال الدهن منه والمحتوي على بروتين الكازين أو البومين مصل دم الثيران Bovine Serum albumin وبتركيز 1% لكليهما ثم يغمر الشريط في محلول الأضداد الأولية ثم في حلول "المترابط" المكون من الأضداد الثانوية المرتبطة بإنزيم الفوسفاتيز القاعدي، علما بأن الأضداد الثانوية هي جلوبيولينات الماعز المضادة الأضداد الأرانب Goat antirabbit immunoglobuline وتضاف أخيرا المادة الأساس وهي خليط من مركبي Nitro-tetrazolium و Bromo-Cloro-inolyl phosphate وبذلك سيظهر اللون بشكل حزم أرجوانية – بنفسجية، (الشكلين 4 و 5).

تمتاز هذه الطريقة بعدة مزايا هي (1) سهلت الكشف الحقلي عن الفايروسات حيث يمكن بصم الأشرطة مباشرة في الحقل وجلبها إلى المختبر لمعاملتها من دون الحاجة إلى جلب العينات كذلك فإن الأشرطة هي سهلة الحمل وتتحمل الخزن لمدة سنة تقريبا من البصم من دون التأثير على كفاءته التشخيصية وبذلك يمكن للباحث إجراء التشخيص في إي وقت يرتئيه خلال هذه المدة (2) توفر معلومات عن طبيعة توزيع الفايروسات في الأنسجة النباتية المختبرة وذلك من خلال طبيعة توزيع اللون على الشريط (3) إن عصر الجزء النباتي المصاب للحصول على العصير كما في الطرق المصلية الأخرى يعطي الفرصة لتخفيف الفايروس بسبب عدم وجوده في الأنسجة الخالية منه لذا فإن هذه الطريقة تجاوزت هذه السلبية لأنها تدمص الفايروس مباشرة من النبات كما تبين تماما موقع وجود الفايروس في النبات وفي أي نسيج تحديدا (4) هي طريقة للكشف عن الفايروسات إذ لا يستغرق إجرائها أكثر من ثلاث ساعات ويمكنها الكشف عن الفايروسات لغاية التركيز 1-5 بيكو غرام (Pg)/مل عصير نباتي. جرى تطوير لهذه الطريقة من قبل HSU سنة 1984 باستعماله للأضداد الثانوية المحضرة في الماعز والمعلمة بالذهب والتي يطلق عليها Gold-labeled goat antirabbit IgG وذلك لزيادة حساسيتها حيث يظهر التفاعل بلون وردي.

2- طريقة البصم البقعي Dot-Blot Assay

تسمى أيضا طريقة الربط المناعي البصمي البقعي Dot-Blot Immunobinding وهي تماثل طريقة بصمة النسيج المناعية TBIA إذ يستعمل فيها أيضا شريط النايتروسيليلوز أو ورق الطباعة العادي Plain paper إلا أن طريقة البصم هي التي تختلف عن الطريقة السابقة حيث يبصم الشريط بعصير النبات المصاب بحقنه بشكل بقع منتظمة صغيرة عليه بواسطة الة "المشعب" Manifold المرتبط بجهاز تفريغ بسيط، حيث يوضع الشريط داخل المشعب الذي يضخ العصير في مواقع محددة على الشريط وبكميات ثابتة لكل بقعة والتي تتراوح بين 25-100 ميكروليتر بعدها يخضع الشريط لنفس إجراءات طريقة بصمة النسيج المناعية حيث تظهر النتائج بشكل بقع لونية بنفسجية تشاهد بسهولة بصريا أو باستعمال جهاز قياس الكثافة الانعكاسي Reflectance densitometer، تعد هذه الطريقة سريعة وبسيطة وحساسة جدا في الكشف عن الفايروسات حيث أن مدة الكشف لا تتجاوز ثلاث ساعات وهي أكثر حساسية مع بعض الفايروسات من طريقة الاليزا المباشرة، كما جرى تطوير لطريقة تنفيذها وذلك بإجراء البصم الكهربائي للشريط Electroblotting بدل الضخ بتأثير عملية التفريغ.

الشكل (4): عملية بصم شريط النايتروسيليلوز بالورقة النباتية المصابة بعد طيها وقطعها وتبدوا نتائج الكشف بظهور اللون البنفسجي للبصمات (الشكل الأسفل) وهذا دليل وجود الفايروس.

3- طريقة البصمة الغربية Western Blot

هي طريقة جمعت بين البصمة البقعية والترحيل الكهربائي حيث يتم أولا دنتـرة الجسيمات الفايروسية بعد أخذ العصير من النبات وغليه مع محلول "الترس" المنظم Tris buffer وهو المركب Tris-hydroxymethyl-aminoethane hydrochloride مضافا إليه مادة التنظيف SDS لغرض تفكيك جسيمات الفايروس لتسهيل مرور الجسيمات في الهلام، مع إضافة الميركا بتوايثانول 2-mercaptoethanol كمادة مانعة للتأكسد مع الجليسيرين ثم يعرض المزيج إلى الترحيل الكهربائي وتمرر الجسيمات في هلام "البولي اكريل أمايد" Polyacrylamide الممزوج مع SDS فتنفصل وحدات الكابسيد وفقا لوزنها الجزيئي وتقارن مع معلمات جزيئية" Molecular markers معلومة الوزن الجزيئي وكذلك مع بروتين العصير النباتي السليم ثم ينقل الهلام بعد انتهاء الفصل الكهربائي ويوضع فوق صحيفة شريط النايتروسيليلوز أو تستعمل أغشية من مادة PVDF المماثل له بالمساحة تماما وبذلك يتم بصم الشريط كهربائيا Electroblotting بحزم البروتينات الموجودة في الهلام، ثم يعامل الشريط بالطريقة ذاتها التي يعامل بها في طريقة بصمة النسيج المناعية وتظهر النتائج بشكل بصمات لحزم البروتينات الفايروسية، تستعمل هذه الطريقة أساسا لدراسة خصائص البروتينات الفايروسية وتقدير أوزانها الجزيئية والكشف عنها في النباتات المصابة والمعدلة وراثيا ولكنها أقل استعمالا في تشخيص الفايروسات كذلك فهي غير مناسبة للتعامل مع أعداد كبيرة من العينات.

الشكل (5): مخطط يبين مبدأ طريقتي البصم المناعي والبصمة الغربية حيث يتم في الاولى وكما مبين في الجزء الايمن من الشكل تثبيت الفايروس على غشاء النايتروسيليلوز ببصم الغشاء مباشرة بالعصير النباتي الحاوي على الفايروس، أما في طريقة البصمة الغربية فانه يتم تثبيت الفايروس على غشاء النايتروسيليلوز أو النايلون بعد فصله كهربائيا بطريقة الترحيل الكهربائي أولا ثم وربطه بالغشاء ثم يتم الكشف عنه بذات آلية عمل اختبار بصمة النسيج المناعية وبالطريقتين المباشرة وغير المباشرة.

الشكل مقتبس من Cann (2005).

و- طرق الاليزا المحورة

جرت تحويرات أخرى كبيرة على الاليزا التقليدية حيث دمجت مع طرق أخرى والغاية هي زيادة كفاءة الكشف عن الفايروسات، وضمت الطرق المحورة الأتية:

1- طريقة البايوتين – أفيدين Biotin - Avidin method

تعتمد هذه الطريقة على الألفة العالية جدا بين بروتين الأفيدين ومركب البايوتين حيث يرتبط الأخير كيميائيا مع الأضداد من الطرف الثابت للضد (FC) وبذلك لا يؤثر على القدرة الارتباطية للأضداد مع الجسيمات الفايروسية أما الأفيدين فيرتبط مع الإنزيم وبذلك سيكون "المترابط" المحور بدل المترابط التقليدي المستعمل في طرق الاليزا، عليه سيتم في هذه الطريقة ارتباط الضد مع الجسيمة الفايروسية من الجهة المتغايرة للضد ومع البايوتين من الطرف الثابت للضد وسيرتبط الأفيدين مع البايوتين بحكم الألفة العالية جدا بينهما وقد أدى هذا التحوير إلى زيادة حساسية الكشف عن السلالات أو الأنماط المصلية الفايروسية Serotypes والتي تعجز عنها طرق الاليزا العادية.

2- الاليزا بالمادة الأساس المفلورة Flurogenic substrate ELISA

طورت هذه الطريقة من قبل Torrance و Jones سنة 1982 لزيادة حساسية الاليزا المباشرة باستعمال مادة أساس مفلورة يعمل عليها إنزيم الفوسفاتيز القاعدي وهي 4-methyl umbellifery phosphate وقراءة النتائج باستعمال جهاز المطياف، ثم أضاف Reichenbacher سنة 1984 تطويرا آخر والذي أطلق عليه "الاليزا فائقة الدقة " Ultramicro ELISA باستعمال المادة الأساس أعلاه وباستعمال أطباق خاصة بحجم 10 ميكروليتر لكل حفرة.

3- الاليزا المحورة باستعمال قطعة الضد 2(F(ab

طورت هذه الطريقة من قبل Barbara و Clark سنة 1982 لتحسين الاليزا غير المباشرة حيث يتم اصطياد الفايروس بواسطة جزء مفصول من الضد IgG وهي القطعة 2(F(ab والتي تمثل المنطقتين الثابتة والمتغايرة للسلسلة الخفيفة للضد (الشكل 6) والتي ترتبط مع جسيمة الفايروس المرتبطة بحفر طبق الاليزا ثم يضاف "المترابط " المكون من الإنزيم المرتبط مع البروتين A ذو القدرة الارتباطية مع القطعة ₂(F(ab، وبذلك أدى هذا التحسين إلى الاقتصاد في استعمال الضد والاستغناء عنه في تحضير المترابط، استعملت هذه الطريقة بكفاءة في تشخيص فيروسات أشجار الفاكهة صغيرة الثمار.

الشكل (6): مخطط للضد IgG يبين السلسلتين الثقيلة والخفيفة والمنطقتين المتغايرة والثابتة.

الشكل مقتبس من Mahy و Van Regenmortels (2008).

4- الاليزا المناعية الشعاعية Radioimmune ELISA

طورت من قبل Ghabrial و Sheperd سنة 1980 لزيادة كفاءة وحساسية الاليزا المباشرة حيث استبدل المترابط التقليدي (الإنزيم المرتبط بالضد) بمترابط مشعع وذلك بتعليم الضد باليود المشع ¹²⁵I مما سهل الكشف عن الفايروسات.

5- الاليزا على حبيبات البوليسترين ELISA on polystyrene beads

استعملت حبيبات البوليسترين بقطر 6,5 ملم بدل طبق الاليزا البلاستيكي وبواقع حبيبة واحدة لكل اختبار حيث ثبت كفاءة هذا التحوير في الكشف عن بعض أنواع الفايروسات مقارنة بالاليزا التقليدية ومنها فايروس موزائيك فول الصويا (SMV).

4. طرق الفلورة المناعية (الصف المناعي)

تستعمل طرق الفلورة المناعية (اللصف المناعي) Immunofluorescence methods للكشف المباشر عن الفايروسات داخل نسيج النبات الحي وتنفذ بأخذ سلخة من نسيج النبات المصاب وتثبيتها على الشريحة الزجاجية المستعملة للفحص بالمجهر الضوئي وإضافة محلول جزيئات الضد المعلمة بصبغة مفلورة Fluorescent dye والتي ترتبط بجسيمات الفايروس وبالتالي يمكن تحسسها في النسيج النباتي بسهولة باستعمال مجهر لاصف (فلورسنتي) اعتمادا على الضوء الصادر من المادة المفلورة وأكثر الصبغات المفلورة استعمالا هي صبغة  Fluorescienisothiocyanate او صبغة Tetramethylrhodamineisothiocyanate اذ تعطي الصبغة الأولى ضوءا أخضرا مصفرا فيما تعطي الثانية ضوءا أحمرا برتقاليا. جرى تطوير لهذه الطريقة بابتكار الطريقة غير المباشرة والتي يتم فيها تعليم الأضداد الثانوية بالصبغة المفلورة ويقصد بالأضداد الثانوية هي الأضداد المحضرة ضد جزيئات الضد IgG والتي ترتبط بالأضداد الأولية غير المعلمة. من الضروري استعمال أنسجة سليمة للمقارنة وذلك لاحتمال حصول الفلورة غير المتخصصة أو تسمى "الفلورة الذاتية" Autofluorescence مما يربك النتائج لذا فان استعمال المحلول الغالق وهو مصل دم الثيران Bovine Serum albumin قد يكون مفيدا في منع التفاعلات غير المتخصصة وغير المرغوب فيها، كما تعد هذه الطريقة مفيدة في الكشف عن الفايروسات في نواقلها الحشرية. عملية الصف (الفلورة) فيزيائيا هي إطلاق الضوء من قبل الجسم المتفلور بسبب امتصاصه للضوء الصادر من مصدر ضوئي معين ثم إطلاق جزء من ذلك الضوء وهي صفة تمتلكها العديد من الجزيئات الحيوية الخلوية حيث أن قاعدة الكوانين ومشتقاتها تطلق ضوءا أزرقا بنفسجيا عند تعريضها للأشعة فوق البنفسجية عند أس هيدروجيني منخفض مما يسهل تشخيصها في الاختبارات الكروماتوغرافية، وتمتص الأحماض النووية الصبغات المفلورة مثل صبغة "الأكريدين البرتقالية" Acridine orange وبذلك يسهل تحديد مواقع الأحماض النووية داخل الخلايا باستعمال المجهر الضوئي وأن الأحماض النووية مفردة الخيط هي الأكثر امتصاصا لهذه الصبغة وتعطي ضوءا ناريا أحمر فيما تعطي الأحماض النووية مزدوجة الخيط ضوءا أخضرا مصفرا. إن هذه الصبغات هي صعبة الدخول في الأنسجة النباتية سميكة الجدران لذلك يعامل النسيج النباتي بإنزيمات تحليل البروتينات ومنها إنزيم Pronase أو يعامل بأنواع من الإنزيمات المحللة للأحماض النووية وذلك لتسهيل دخول الصبغة. يطلق مصطلح " العنصر ألاستشفافي" Tracer على أية مادة متفلورة أو مشعة إذا استعملت لمتابعة جسيمة معينة داخل النسيج النباتي أو خارجه بسبب ما تصدره من ضوء ولذا يطلق على الأضداد المرتبطة بصبغة مفلورة مصطلح "الأضداد الاستشفافية" Antibody tracer والتي تستعمل لتحسين الطرق المصلية وخاصة في طريقة الانتشار المزدوج في الأكار.