الاجهادات في الخمائر

تمثل الخمائر وخاصة خميرة الخبز S. cerevisiae المتبرعمة نموذجا دراسيا جيدا للدراسات الجزيئية لحقيقيات النواة، كما انها تعد افضل المضايف لانتاج البروتينات العلاجية وغيرها من الاغراض، وتدرس بعض الخمائر من النواحي الجزيئية لأهميتها، فمثلا C. albicans تعد من الممرضات المزعجة، اما الخميرة Debaryomyces hansenii البحرية فتدرس لمعرفة أسباب مقاومتها لتراكيز الصوديوم العالية جدا، وتدرس الخمائر الملوثة للأغذية مثل الخميرة Zygosaccharomyces rouxii لمحاولة ايجاد افضل السبل لحفظ الاغذية، وتدرس خميرة Sz. Pombe المنشطرة التي تختلف عن خميرة الخبز ولكن الاثنان لهم شبه بالخلايا الحيوانية لذلك تكون وسائل دراسية مهمة.

ونظرا لكون الخمائر احياء وحيدات الخلية لذلك وجب ان تكون وسائل دفاعها كفوءة كي تعيش في بيئات تتذبذب فيها الظروف. وبصورة عامة فان المستويات الواطئة من عوامل الاجهادات تؤدي الى استجابة التطبع والتي تكون مرحلة انتقالية لمقاومة المستويات الاعلى لذلك كانت الخلايا المتطبعة والمدربة أكثر كفاءة في العيش عند حدوث حالات الاجهاد، وترافق عمليات التطبع تخليق البروتينات الملائمة والذي يعني بدوره تغير التعبير الجيني، ففي خميرة الخبز فان 10 – 14% من الجينات يتغير التعبير عنها عند الاجهاد. فالجينات التي تحث تعمل في مجالات ايض الكاربوهيدرات (لتوفير الطاقة) وازالة سمية مركبات الاوكسجين الفعالة، وكذلك انتاج بروتينات تقوم بطوي البروتينات المتضررة او تفكيكها، وكذلك تغير فعالية الفجوات والمايتوكوندريا وعمليات الالتهام الذاتي Autophagy ونقل مواد الايض. اما الجينات التي تكبح عادة فهي تلك العاملة في مسارات استهلاك الطاقة والمتعلقة بعمليات النمو مثل معالجة RNA، الانتساخ والترجمة للبروتينات غير الضرورية, وتخليق الرايبوزومات وهذه تعرف باستجابة الاجهاد البيئية (Environmental stress response (ESR والاستجابات البيئية العامة (CER) Common environmental response.

ويمكن ان تحصل التداخلات بين الاستجابات والتي تشير الى ان ظروف الاجهاد يمكن ان تنشط آليات دفاع متشابهة او وجود آليات عامة تسيطر على الاستجابات للاجهادات مظهرة مستوى أساسي من الحماية.

وتحوي الخمائر على (STRE) Stress response element كتسلسل موجود في معظم ممهدات الجينات التي تنشط تحت ظروف الاجهاد الخاصة مثل الصدمة الحرارية، ومجاعة النتروجين والاجهاد التأكسدي وغيرها وهذه العناصر تسهل انتساخ الجينات الحاوية عليها.

الوصيفات وبروتينات الصدمة الحرارية

تعد دراسة هذه المجموعة من البروتينات مهمة لأنها تشارك في عمليات التخليق الحيوية للبروتينات عامة Protein biogenesis وقد ذكر سابقا ان مجموعة البروتينات هذه ترافق او تلازم البروتينات الجديدة منذ ظهورها على شكل بيبتيدات من الرايبوزومات الى مراحل التحوير والطوي الى الشكل الفعال ثم توصيلها الى الاماكن التي تعمل فيها لذلك سميت بالمعدلات او الوصيفات الجزيئية. وتوجد أنواع منها في الخميرة Hsp60 Hsp90 , Hsp 70 وغيرها والتي تساهم في التخليق الحيوي للبروتينات وتكون ثابتة ومحافظ عليها في العديد من الاحياء.

ومساهمة بروتينات الصدمة الحرارية في تخليق البروتينات الحيوي يكون بواسطة طوي البروتينات وتجميع الوحدات الفرعية للبروتينات او الانزيمات داخل الانظمة الحية والتي لا يمكن ان تكون عملية تلقائية بحتة. فالوصيفات ترتبط للسلاسل الجديدة بشكل مؤقت وبشكل لا تساهمي وكذلك ترتبط الى البروتينات غير المطوية والبروتينات غير المجتمعة لتؤدي في النهاية انتاج بروتينات سليمة ويكون ذلك بواسطة التداخلات بين البروتينات – البروتينات لتطوى الجديدة بشكل صحيح، وتعد Hsp70 , Hsp 60 الاهم من الوصيفات الجزيئية و Hsp70 وجد في كل الخمائر التي فحصت وتختص بالارتباط الى البروتينات غير المطوية مثل تلك الناشئة حديثا لتكمل معالجتها الى النهاية.

وفي الخميرة يوجد Hsp70 في داخل المايتوكوندريا وعلى الشبكة الاندوبلازمية ويلعب دورا أساسيا في نقل البروتينات من السائل الخلوي الى العضيات بالارتباط للبروتينات المراد نقلها في المراحل الأولى من عمليات النقل.

اما (Cpn60) Hsp60 فيوجد في الخلايا بدائية وحقيقية النواة ويمكن ان يرتبط بالبيبتيدات غير المطوية داخل وخارج الانظمة الحيوية ويمنع تجمعها وتكتلها العشوائي ويقوم بعمليات طويها، واضافة الى Hsp60 , Hsp70 توجد بروتينات اخرى تقوم بعمليات التعديل ومنها Hsp90 وانزيمات Proline isomerases وكذلك Protein disulfide isomerase PDI . ويوجد Hsp140 الذي يخلق تحت ظروف الاجهاد ويقوم بالوظائف نفسها المذكورة اعلاه.

Hsp70

 من البروتينات الثابتة بشكل كبير في كل الانواع من البكتريا الى الإنسان وما يقابله في E. coli هو DnaK الذي يشابه بنسبة 50% نظيره في الخلايا  حقيقية النواة، اما Hsp70s في حقيقيات النواة فتظهر تشابها فيما بينها بنسب تتراوح بين 50-90%، وهي تحوي على نهاية امينية تشغل ثلثي البروتين وتكون أكثر ثباتا من النهاية الكاربوكسيلية والتي تمثل الثلث الباقي. وتمتاز البروتينات بان لها أكثر من موقع لأداء وظيفة معينة. فهي تحوي على جزء له الفة عالية للارتباط للـ ATP وجزء آخر للارتباط للبيبتيدات. وفي بروتينات Hsp70 من الخلايا البشرية يكون الجزء في النهاية الامينية بوزن جزيئي 44 كيلو دالتون له فعالية تحليل البروتينات وكذلك تحليل (ATPase) ATP ولكن الاخيرة لا تتحفز بارتباط البروتين للبيتيدات، وهذا يشير الى اختلاف مواقع الارتباط وهو بذلك يشابه ارتباط ATP للـ G actin في الخميرة. اما النهاية الكاربوكسيلية (في الإنسان) فتظهر تشابها مع (Major histocompatibility complex) MHC I من حيث التركيب الاولي والثانوي، وفي اللبائن فان Hsp70" الموجود على الشبكة الاندوبلازمية يطلق عليه Bip.

ان اطلاق البيبتيد المعدل من Hsp70 يحتاج الى طاقة تأتي من تحلل ATP وهذا يشير الى تداخل الطرف الاميني الذي يملك قابلية التحليل (ATPase) مع الطرف الكاربوكسيلي الذي يحمل البيبتيد ويكون ذلك بحصول تغيرات شكلية في توزيع الجزيئة .

وخميرة الخبز تحوي عددا من Hsp70s كما هو الحال في معظم حقيقيات النواة، 2 منها في العضيات وهي Ssc 1p ارضية المايتوكوندريا و Kar 2p في جوف الشبكة الاندوبلازمية، اضافة الى وجود 6 تتوزع على مجموعتين او عائلتين، 4 تعود للمجموعة SSA و 2 تعود الى SSB والبروتين Ssc 1p يشبه DnaK في E. coli  وهذا يدعم الرأي القائل بأن المايتوكوندريا هي خلايا بدائية النواة تطفلت في الخلايا حقيقية النواة. والجين المسئول عن Ssc 1p وهو Ssc1 موجود في النواة يعطي ناتجا يعاني من التحوير اذ تزل منه 28 حامض أميني عند النقل ليعطي البروتين Ssc 1p في المايتوكوندريا، ويخلق البروتين طول حياة الخلية ويشارك في نقل البروتينات من السائل الخلوي الى المايتوكوندريا.

أما Kar 2p فيوجد في الشبكة الاندوبلازمية ويسمى Bip فيرتبط بالعديد من البروتينات، ويكون مسئولا في الخمائر عن منع حصول الاندماج النووي ويكون ضروريا لعيوشية الخلايا، ويشارك في عمليات نقل البروتينات بين الأجزاء الخلوية لخميرة الخبز.

وبروتينات SSA الأربعة فتوجد في السائل الخلوي، 3 منها تحث بالحرارة وتكون ضرورية لبقاء الخلايا حية، فحدوث ضرر في SSA2 , SSA1" يؤدي الى بطيء نمو الخميرة وعدم قابليتها على تكوين المستعمرات بدرجة حرارة 37م◦. وتتداخل هذه البروتينات مع بعضها من النواحي الوظيفية وتشارك في نقل البروتينات بين أجزاء الخلية.

وبروتينات SSB يتوقف تخليقها بالحرارة ويوجد جينيان لتخليقها، وتتشابه في الوظائف التي تؤديها وتعطي النمط المظهري نفسه للخلايا، وعند تلف احد الجنينين يؤدي الى جعل الخلايا بطيئة النمو وحساسة للبرودة، وتكون كمياتها كبيرة تحت الظروف الاعتيادية، وتساهم في عمليات الترجمة على الرايبوزومات.

في E. coli كما ذكر توجد بروتينات مساعدة للـ DnaK" وهي GrpE , DnaJ فالأول يقوم بعملية تحليل ATP والثاني يساعد في الإطلاق الكفوء، في حين في الخمائر والانسان توجد 4 بروتينات مشابهة للـ DnaJ.

Hsp60 :

توجد في العديد من الاحياء وفي الخميرة يوجد في المايتوكوندريا ويكون مشابها للـ GroES في E. coli. وتشمل مجموعة Hsp60 مجموعة اخرى من البروتينات الثابتة ويعرف أيضاً Cpn60 . ويتكون من حلقتين منضدة فوق بعضها وكل حلقة مكونة من 7 وحدات فرعية، في E. coli يساهم في طوي البروتينات كما مر ذكره، وفي الخمائر GroEL  5(كيلو دالتون) مع البروتين الاخر GroES  يحفزان بالحرارة ويشترك الاثنان في طوي البروتينات غير المطوية، اذ يرتبط الى اليبتيد غير المطوي، وبعد طويه يطلق بمساعدة تحلل ATP التي يقوم بها GroEL.

ويشفر للـ Hsp60 في الخمائر بالجين MIF4 الموجود في النواة، ويعتقد انه يشارك في نقل البروتينات بين أجزاء الخلية. Hsp60 الخلوي يوجد في السائل الخلوي ومقابله في الحيوانات Tcp1 وهو يشابه في الوظيفة اذ يشارك في طوي بروتينات الهيكل الخلوي وهي الاكتين و Tubulin وكذلك يساهم في عمليات التخليق الحيوي للبروتينات. وكل من Hsp70 , Hsp60 تعمل في الخمائر او غيرها من الاحياء بشكل متتابع في مسارات عامة.

Hsp90

من البروتينات التي توجد في البكتريا والخمائر واللبائن، ويوجد بكثرة في حقيقيات النواة وفي الخمائر يوجد منه 2 الأول Hsc82 يوجد بمستويات عالية دون الحاجة الى عمليات حث، والاخر Hsp82 ويكون مستواه واطئا ويستحث بالحرارة ليصل تركيزه الى 10 – 15 مرة مقارنة بالحالة الطبيعية. وفي الفقريات يكون Hsp90 مرتبطا بعدد من الوظائف مثل كاينيز التايروسين ومستلمات الهرمونات الستيرويدية، ولذلك يعتقد انه يعمل في مجال التنظيم، ويقوم بتثبيت البروتينات المتصلة به الى ان تصل الى مكانها.

ويحوي البروتين على موقع او مستلم يربطه بالـ DNA، عند انطلاق Hsp90 من المعقد مع مستلم الهرمونات يؤدي هذا الى تغيير المستلم على Hsp90 ويصبح من غير قادر على الارتباط بالـ DNA الى شكل قادر على الارتباط. كما انه يشترك في تكوين معقدات المستلمات الخاصة به أي ان له دورا مهما في التخليق الحيوي للمستلمات، ويشارك Hsp90 في تعديل بعض الانزيمات وقطع Fab في الأجسام المضادة وحيدة النسيلة Monoclonal antibodies .

Hsp140

يكون مستوى البروتين في الظروف الاعتيادية واطئا ولكنه يستحث بالحرارة بقوة، ولذلك يعتقد انه ليس ضروريا عند النمو تحت الظروف الاعتيادية. والخمائر تموت عند حرارة 50م◦ ولكن عند التدريب بالحضن عند حرارة 37 م◦ فان Hsp140 ضروريا للتحمل الحراري في طور الاستقرار وكذلك في الابواغ التي تكونها، ويكون ضروريا أيضاً لتحمل الكحول الاثيلي. وهو يشابه افراد عائلة ClpB , ClpA المستحثة بالحرارة في E. coli ، وهذه العائلة تعمل في E. coli في مجال تفكيك البروتينات ، ClpA لا يفكك البروتينات وانما يعمل كـ ATPase الذي يساعد في تنظيم ClpP. ولذلك فان Hsp140 ليس من البروتيزات وانما يعمل على تنظيمها ربما من خلال تداخلات بروتين – بروتين.

ومن البروتينات الاخرى العاملة في الخمائر وغيرها من الاحياء في عمليات التعديل هي انزيمات المزامرة Isomerases ومنها :

•        (PDI) Protein disulfide isomerases تساعد في تكوين الأواصر الكبريتيدية الثنائية في البروتينات المختزلة وهذه توجد في داخل الشبكة الاندوبلازمية في الخميرة وباقي حقيقيات النواة. وتساهم بشكل فاعل في طوي البروتينات في داخل الانظمة الحية ويشفر لها في الخميرة بالجين PDI 1.

•        انزيمات مزامرة البرولين Proline isomerases مثل Peptidyl – porlyl – cis – trans – isomerase)) ((PpI تعمل على مزامرة Cis-trans عند وجود البرولين في السلسلة البيبتيدية، وتعمل على طوي البروتينات المعتمدة على مزامرة البرولين (Proline isomerization).

وتوجد بروتينات مشابه لها ترتبط بالأدوية المحبطة للمناعة مثل Cyclophilins التي ترتبط بـ Cyclosporin A وتعمل بروتينات Cyclophilins على طوي البروتينات، ويوجد مثلها في الدروسوفيلا في الشبكة الاندوبلازمية للخلايا المستلمة للضوء Photoreceptor cells ويساهم في طوي البروتينات وتوجيه بروتينات Rhodopsins، وتوجد بروتينات اخرى ترتبط بأدوية اخرى.

تحليل البروتينات

عند تعرض الخلايا للظروف غير الطبيعية او الاجهادات فان بروتيناتها تمسخ وتصبح غير مطوية وغير فهالة، وهناك طريقان للتعامل معها :

•        استعادة تركيبها الطبيعية بمساعدة الوصيفات الجزيئية.

•        تفكيكها عند عدم امكانية تصحيحها.

وعليه فان الوصيفات الجزيئية تساعد في عملية التفكيك وتكون عمليات التفكيك في أغلب الأحيان ضمن مسار المدمر Ubiquitin pathway وهو الطريق المتبع لتفكيك البروتينات في حقيقيات النواة وبعض مكوناته تنشط تحت ظروف الاجهاد.

وفي الخمائر يشفر للمدمر بأربعة جينات UBI الذي يكون ضروريا لبقاء الخلايا حية تحت الظروف المجهدة وذلك بتزويدها بجزيئات المدمر تحت ظروف الاجهاد وتشارك بعض مكونات المدمر في تجميع الرايبوزومات وبشكل أدق تجميع بروتينات الرايبوزومات وبذا فهو يقوم بوظيفة الوصيف، وهناك العديد من إنزيمات خميرة الخبز التي يمكنها الارتباط بالمدمر وكلها تشترك في احتوائها على جزء يحوي على السستيئين الذي يرتبط به المدمر بشكل تساهمي. ويساهم المدمر في العديد من الفعاليات الحيوية منها بعض عمليات اصلاح DNA واخرى تعمل على استمرار دورة الخلية من مرحلة G1 الى مرحلة التخليق S . اضافة الى مشاركته في تدمير البروتينات المتضررة. والبروتينات المدمر بروتين ثابت مكون من حوالي 76 حامض أميني وعندما يتحفز يكون مركب نشط مع الانزيم المنشط له، ثم ينقل مادة الأساس (البروتينات او الانزيمات) المراد تفكيكها الى جسيم التحلل البروتيني الذي يوجد في العديد من الاحياء.

جسيم التحلل البروتيني في الخمائر وخلايا اللبائن يكون بمثابة تركيب اسطواني بحجم 20S) S وحدة الترسيب)، ويتكون على الاقل من 12 وحدة فرعية مرتبة بشكل 4 حلقات متراصة. خارج الأنظمة الحية يظهر الجسيم ثلاث فعاليات منفصلة من Endopeptidases ، ولكن يبدو ان هناك بروتين اخر او بروتينات اخرى تشارك في تفكيك البروتينات المتضررة داخل الخلية يعرف بـ 26S. ويوجد الجسيم في العديد من الاحياء وفي خميرة الخبز فان الجين pRE 1 يشفر لإنزيم مشابه للـ Chymotrypsin .

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .