تشخيص الإصابات الفطرية وعزل الفطريات الممرضة

Identification of Fungal Infections &Isolation of Plant Pathogenic Fungi

تشخيص الإصابات الفطرية

Identification of Fungal Infections

تتميز الإصابات الفطرية عادة بظهور أعراض مميزة أو علامات الفطر. لغرض التعرف على الفطريات المسببة للمرض على النبات ينبغي فحص النماذج المصابة أولا فقد يكون الفطر المسبب ناميا على الجزء المصاب مكونا غزلا فطريا وأبواغا او أجساما حجرية وهذا يمكن ان يتحقق بالفحص بعدسة مكبرة (في الحقل) او المجهر المجسم أو المجهر الضوئي المركب (في المختبر). وفي حالات عديدة يمكن تشخيص الفطر المسبب من خلال معطيات الفحص المجهري والأعراض الظاهرة على النبات او الجزء المصاب. ولكن في حالات كثيرة ايضا لا تظهر نموات الفطر او علاماته بشكل واضح على النسيج المصاب. في هذه الحالة يمكن وضع النبات او العضو المصاب منه في غرفة رطبة لمدة 24 - 48 ساعة لغرض تشجيع الفطر على النمو وتكوين الأبواغ التي تسهل عملية التشخيص في أغلب الحالات يتوجب عزل الفطر على وسط زرعي عام أو خاص من أجل التمكن من فحصه جيدا وتشخيصه. لكن ليس جميع الفطريات الممرضة للنبات يمكن أن تنمو على الأوساط الزرعية. فمسببات أمراض البياض الدقيقي والزغبي ومعظم مسببات أمراض الصدأ (بعضها يمكن زرع اطوار معينة من دورة حياته) ومسببات أمراض التفحم لا تنمو على الأوساط الزرعية وهي طفيليات مجبرة.

في حالة التمكن من مشاهدة نموات الفطر وتراكيبه التكاثرية يمكن تشخيص الجنس الذي ينتمي اليه الفطر في الكثير من الحالات مستعينين بالمراجع المناسبة. لكن تشخيص النوع يتطلب دراسة مستفيضة وتنمية الفطر على اوساط خاصة أو حضانته في ظروف حرارة وإضاءة معينة. ويتطلب الأمر في الكثير من الحالات تخصص وخبرة مناسبة مع توفر المراجع المطلوبة. مع ذلك يمكن أن يتطلب الأمر تأكيد التشخيص من أساتذة متخصصين محليين أو من معاهد عالمية معروفة.

عزل الفطريات الممرضة للنبات

Isolation of Plant Pathogenic Fungi

في أغلب الحالات لا يوجد الفطر المسبب للمرض لوحده على النبات او العضو المصاب. هناك الكثير من أنواع الفطريات والخمائر والبكتريا والحيوانات الابتدائية الموجودة عادة على سطوح الأجزاء النباتية (المنابتات Epiphytes والملوثات) وأحيانا بداخلها (المستنبتات Endophytes) أو كمسببات مرضية ثانوية نمت بعد الإصابة الأولية بالفطر وكسر دفاعات العائل. وعليه فإن توفير وسط غذائي ينقل اليه جزء من العضو أو النسيج النباتي المصاب يعني نمو الفطر المسبب ومعه واحد أو أكثر من هذه الأحياء الدقيقة. الغلبة او الظهور ستعتمد على سرعة النمو وعدد الوحدات اللقاحية الخ. والتي ربما تكون لغير المسبب المرضي. وللتغلب على هذه المشاكل وغيرها ثمة اجراءات متسلسلة ينبغي إتباعها من أجل الحصول على الفطر المسبب في مزرعة نقية.

1. تنظيف النموذج بغسله تحت تيار من ماء الحنفية من اجل إزالة الغبار او دقائق التربة والكثير من الملوثات الحية.

2. تقطيع العضو المصاب (جذر، ساق أو أوراق) الى أجزاء صغيرة طولها بحدود 1 - 2 سم بحيث تحتوي على البقعة أو القرحة أو التعفن أو التسوس مع منطقة محيطة من الأنسجة السليمة. يتم ذلك لأن الفطر قد يكون ميتا في مركز البقع المصابة بينما يكون حيا في الأنسجة المحيطة بها.

3. التعقيم السطحي من اجل قتل الملوثات من الأحياء الدقيقة والتي تبقت بعد عملية الغسل علما ان هذه العملية ستؤثر على الفطر المسبب للمرض إذا ما تعرضت اجزاؤه لها. لذلك لا بد من أن تكون عملية التعقيم لفترات مختلفة الطول يمكن خلالها أن يبقى جزءا من الفطر المسبب حيا. عموما تعرض الأجزاء الرقيقة الغضة كالأوراق أو الجذور الصغيرة لفترات أقصر من تعريض السيقان أو الجذور السميكة أو البذور. تتم عملية التعقيم بواسطة غمر قطع الأجزاء المصابة بالمحلول المعقم هيبوكلورات الصوديوم 0.5% (محلول الكلوراكس التجاري مخفف 1 الى 9) وهو الأكثر استخداما او كلوريد الزئبقيك 0.1٪ علما أن هذه المادة سامة جدا أو الكحول الأثيلي 70 %. بعد عملية الغمر في محلول هيبوكلورات الصوديوم ترفع بعض القطع بعد دقيقة واحدة ثم ترفع مجموعة اخرى بعد دقيقة ونصف وهكذا لحد 3 دقائق وتنقل الى الماء المعقم الموجود في 3 كؤوس او أطباق بتري موضوعة بالتسلسل حيث ينقل منها بالتتابع من أجل تخليص النموذج من متبقيات المادة المعقمة بعد الغسل الأخير تنقل النماذج الى طبق بتري يحتوي على ورق نشاف معقم من أجل تخليصها من الماء الزائد بعدها تنقل الى اطباق تحتوي على وسط ماء أكار (2 % Water Agar ) وأخرى تحتوي على وسط غذائي عام للفطريات مثل بطاطا دكستروز أكار (Potato Dextrose Agar (PDA أو مالت أكار (Malt Agar) أو تشجابكس أكار (Capeck's Agar) الخ . الوسط ماء أكار يتكون من ماء ومادة الأكار المصلبة الخاملة والخالية من المواد الغذائية فهو يوفر بيئة رطبة مناسبة لدعم نمو الفطر الذي يستحصل المادة الغذائية من النسيج النباتي. هذه الطريقة ستحرم الملوثات الباقية المحتملة من المواد الغذائية التي تتيحها الأوساط الغذائية الأخرى بينما تتيح الفرصة أكثر للمسبب المرضي الذي إعتاد على ذلك ويمتلك الإنزيمات اللازمة. الأوساط الغذائية الأخرى الغنية ستوفر المواد الغذائية اللازمة لنمو الفطر المسبب المضعف خلال عملية التعقيم لكنها قد تشجع نمو الملوثات المتبقية. تحضن الأطباق في درجة حرارة 25 - 28 م لمدة 3 - 7 ايام أو أكثر حيث تفحص باستمرار لملاحظة ظهور نموات الفطر.

4. عند ظهور نمو الفطر بشكل مستعمرة أو مستعمرات نقية تنقل اجزاء قليلة منها بواسطة إبرة تلقيح معقمة الى أطباق تحتوي على الوسط الغذائي الغني مثل PDA وتحضن كما سبق ذكره. يتم حفظ الفطر وذلك بتلقيح أنابيب تحتوي على الوسط الغذائي PDA المائل (Slant) أو إلى أنابيب تحتوي على الوسط الغذائي الفقير بطاطا جزر أكار (potate Carrot Agar إذا اريد المحافظة على نمو الفطر لفترات طويلة. أما إذا ظهرت نموات لفطريات أو بكتريا ملوثة الى جانب الفطر المسبب فيتوجب إعادة عزل الفطر من الطبق ونشره على طبق آخر يحتوي على مضاد حيوي (Penicillin + Streptomycin) إذا كان الملوث بكتيري أو على مبيد فطري معروف بتثبيطه لنمو الفطر الملوث (مثلا المبيد Botran معروف بتثبيطه للفطريات الملوثة Rhizopus و Mucor) أو صبغة Rose Bengal أو Congo Red التي تحدد قطر المستعمرات النامية وتمنع انتشارها وتداخلها وغير ذلك أو من خلال تكرار عملية التنقية أو اللجوء الى عملية التخفيف وغيرها من عمليات تنقية المزارع الفطرية.

من بين انواع الفطريات المعروفة ( حوالي 250 ألف نوع ) هناك حوالي 10 آلاف نوعا تسبب أمراضا في النباتات و 300 نوعا تسبب أمراضا في الإنسان والحيوان النوع الواحد يمكن ان يصيب نوع نباتي واحد او اكثر وجميع انواع النباتات يمكن ان تصاب بأنواع معينة من الفطريات.