تجهيز بيئة زراعة الانسجة النباتية

يتوقف نجاح زراعة الأنسجة على عدة عوامل منها محتوى البيئة من العناصر الضرورية للنمو وتناسب تلك المحتويات مع مرحلة زراعة الأنسجة وهي خمسة مراحل. فعلى سبيل المثال يتطلب الأمر خفض تركيز الأملاح المعدنية ومصدر الكربوهيدرات في مرحلة تكوين الجذور للعديد من النباتات على العكس من مر رحلة الإستيلاد التي ربما تحتاج استعمال تركيز عالي من العناصر المعدنية والسكر. كذلك يجب اختيار البيئة المناسبة لتحقيق الغرض المطلوب من زراعة الأنسجة فإذا كان الهدف تخليق المركبات الفعالة فإن الأمر يتطلب إضافة العناصر الهامة في التخليق الحيوي لتلك المركبات وقد أجريت عدة محاولات للوصول إلى أفضل تركيبة من العناصر الصغرى والكبرى بالإضافة إلى الفيتامينات وأحياناً بعض المواد الأخرى غير محددة التركيب مثل لبن جوز الهند وكازين اللبن كمصدر للعناصر الغذائية الضرورية للنمو والتكشف. وكان لاستخدام المحاليل المغذية مثل Hoagland و Knop و Pfeffer في المزارع المائية للنباتات أثر هام في تطوير تركيب البيئات المستخدمة في زراعة الأنسجة، على الرغم من فشل الكثير من العلماء الرواد في مجال زراعة الأنسجة من استخدام تلك المحاليل لنمو الأنسجة في المعمل. فقد كانت البيئات التي استخدمت في بداية تطوير علم زراعة الأنسجة بسيطة التركيب وفقيرة في محتواها من العناصر غير العضوية خاصة من البوتاسيوم والنترات. ويعتبر Nobecourt أول من استطاع إنتاج كالوس من نباتات الجزر باستخدام تركيز مخفف من المحلول المغذى Knop. واعقب ذلك عدة محاولات من مجموعة من العلماء منهم White و Hildebrandt وغيرهم. وقد قام White في الفترة من 1943 حتى 1963 بالعديد من التجارب بهدف التوصل إلى وسط غذائي مناسب لزراعة الجذور لإجراء بعض الدراسات على الفيروسات. فقد استغل أحد البيئات التي تستعمل لنمو بعض الطحالب مع إضافة بعض العناصر المعدنية والجليسين وحامض النيكوتنك والثيامين والبيرودكسين. وبالفعل استعملت تلك البيئة لفترة طويلة في زراعة الأنسجة. وقد كان White صاحب الكتاب الأول عن زراعة الأنسجة والذي شجع الكثير من الباحثين لخوض هذا المضمار الجديد.

لوحظ في البداية أن النباتات الكاملة يمكنها النمو في بيئة تحتوي على أيون النترات فقط لكن لم يناسب ذلك زراعة الأنسجة باستثناء مزارع الجذور. ومن ثم كان معظم التغير في البيئات المستخدمة منصبا على البوتاسيوم والنترات والكالسيوم. وفي عام 1922 تم إدخال الأمونيا إلى بيئة مزارع الأنسجة وكان لها أثرا واضحا في تحسين نمو عدد كبير من النباتات وكان لدراسة تأثير تركيز الأمونيا والنترات والبوتاسيوم أعظم الأثر في إمكانية الحصول على بيئة يمكن استخدامها بنجاح مع عدد كبير من النباتات ولأغراض متباينة. فقد أمكن بزيادة تركيز النترات والبوتاسيوم مع وجود الأمونيا تكوين كالوس وإنتاج أشطاء بطريقة مباشرة وغير مباشرة، وكذلك تكوين الأجنة الجسدية. ورغم أن بعض البيئات تم تركيبها لتلاء م صنف نباتي معين فقد أمكن استخدامها مع أصناف أو أنواع أخرى لكنها قد لا تعطى النتائج المثلى المستهدفة لهذا الصنف أو النسيج.

وكان لاستعمال النتروجين في صورة أيون أمونيوم والنترات بالإضافة إلى تركيز عالي من البوتاسيوم أثر واضح في تحسين نمو الكالس وعموماً لوحظ أن البيئة المناسبة لمعظم الأغراض تحتوي على 30 مول من النتروجين المعدني والبوتاسيوم. وتستعمل أملاح الأمونيوم بتركيز 2 - 20 مليمول وهذا المدى الواسع من التركيز يكون مشجعاً للنمو أحيانا ومثبطا في حالات أخرى. وغالباً يعتبر تركيز 1-3 مليمول من أملاح الكالسيوم، السلفات، الفوسفات، الماغنسيوم مناسبة لمعظم الحالات. ويوضح جدول رقم (1) تركيب عدد من البيئات الشائعة الاستخدام في زراعة الأنسجة وأشهرها (Murashige & Skoog (MS و Linsmair & Skoog's (LS و B5 و NN. إلا أنه من الصعب أن يوصى ببيئة واحدة لزراعة الأنسجة حيث يتوقف ذلك على النوع النباتي وعمر النبات والجزء المنزرع من النبات.

وأشار (1999) .Route et al إلى نجاح الإكثار باستعمال بيئات أخرى مثل Gamborg's & Lee (GL) , LS و Quorine Lepoivre (QL) و Woody plant medium (WPM)  ووجد (2002) Carelli & Echeverrigaray أن لبيئة QL والتي تمتاز بتركيزها المنخفض من الأمونيا مع رفع تركيز الكالسيوم بالمقارنة مع MS أو B5 مع استبعاد الكلورين تأثير إيجابي في الإكثار الدقيق للورد . حيث تعمل على التغلب على أكسدة المواد الفينولية وبذلك ارتفعت نسبة الأجزاء النباتية التي حافظت على حيويتها من 45-25 % إلى 77.5% مع رفع معدل التكشف. وتختلف الاستجابة لتركيز أملاح MS باختلاف الأصناف المختبرة فعلى الرغم من تفضيل استخدام تركيز منخفض من أملاح تلك البيئة للعديد من النباتات الخشبية فإن (1982) .Bressan et al أشار إلى أن ضعف نمو وكثرة التباين في النباتات المستنسخة لبعض هجن الورد ويرجع ذلك إلى التركيز المنخفض من الأملاح. والأكثر من ذلك تمكن (1995) Podwyszynska & Olszewski من معالجة اصفرار الأوراق والموت الموضعي للقمم النامية في مزارع الأنسجة بمضاعفة تركيز الكالسيوم، كما حسن زيادة الكالسيوم والماغنسيوم والمنجنيز والحديد من نمو الأشطاء. وقد وجد تأثير ايجابي لنترات الفضة على سرعة ومعدل التكشف.

جدول 1: مكونات بعض البيئات شائعة الاستعمال في زراعة الأنسجة النباتيه.

بيئة Murashige & Skoog

كان Murashige طالبا في معمل Skoog وكانت دراساته تنصب على نمو خلايا نخاع الدخان التي يستخدمها كطريقة للتقدير الحيوي للسيتوكينينات. وقد لاحظ أن إضافة المستخلص المائي لأوراق الدخان إلى بيئة White يشجع نمو مزارع النخاع بشكل ممتاز. وتوصل إلى أن ذلك راجعاً إلى العناصر المعدنية الموجودة بالمستخلص حيث حقق نفس النتيجة باستعمال الرماد المتبقي بعد حرق الأوراق (2008 ,Vasil) وبعد هذه الملاحظات الأولية اعتمد هو واستاذه في تحضير هذه البيئة على تحليل أنسجة النبات لتحديد التركيز الأمثل من العناصر المعدنية في البيئة. وتعتبر هذه البيئة من أشهر البيئات استعمالاً في مزارع الأنسجة حيث تمثل تقريباً 25% من البيئات التي استعملت كما أن 50% من النباتات التي نجحت زراعتها في مزارع الأنسجة كانت باستخدام تلك البيئة (1995 ,.Leifert et al) يبين جدول رقم (2) تركيز العناصر الأساسية في تلك البيئة ومتوسط تركيزها في النباتات في الظروف الطبيعية (Thorpe et al., 2008).

جدول 2: مقارنة بين تركيز العناصر الأساسية في بيئة MS وأنسجة الأفرع للنبات على أساس الوزن الجاف (2008 ,.Thorpe et al).

ويتضح ايضا التركيز المنخفض من الكالسيوم والفوسفور والماغنسيوم والنحاس وارتفاع تركيز الكلور والمولبيدنيوم بالمقارنة مع أنسجة النبات. كما أن تركيز الأمونيا والنترات فيها أعلى خمس مرات من تلك التي كانت تستعمل سابقاً بواسطة Meller. وكذلك فإن تركيز النتروجين الكلى أعلى عدة مرات من تركيز النتروجين الذي استعمل بواسطة Hildebrandt و White وأيضاً ارتفع تركيز البوتاسيوم فيها حوالي 11 مرة أما الفوسفور فقد زاد تركيزه 13 مرة هذا بالإضافة لزيادة تركيز العناصر الصغرى. وكان لهذا التعديل الكبير أثراً واضحاً في تحسين النمو والتكشف.

ورغم أن MS تم تركيبها لتلاءم نمو كالوس وأفرع نباتات الدخان إلا أنه ثبت نجاحها لعديد من النباتات الأخرى. ثم أعقب ذلك تحديث مكوناتها وكان معظم التغير في تركيز أيون النترات والأمونيا والبوتاسيوم بينما لم يتغير تركيز معظم الأملاح الأخرى وبعد ذلك أضيفت الأحماض العضوية للبيئة بغرض تحسين النمو أو استعمالها كمضادات أكسدة. وبعد تلك التعديلات وجد أن مستوى الفوسفور منخفض ولا يلاءم عدد كبير من الأنواع النباتية الأخرى، لذا تم تعديل مكونات البيئة بعد ذلك برفع تركيز الفوسفور.

لكن يلاحظ ترسيب بعض العناصر مثل P و Ca و K و N و Zn و Mn فبعد سبعة أيام من تجهيز البيئة يلاحظ ترسب 50% من الحديد و 13 % من الفوسفات، وقد يحدث الترسيب اثناء التعقيم مما يسبب خلل في تركيب البيئة. لكن يلاحظ من مقارنة تركيز أملاح البيئات شائعة الاستعمال ارتفاع تركيز الأملاح في بيئة MS. لذا استعمل الكثير من الباحثين تركيزات منخفضة من هذه البيئة فقامPedraza-Santos et al (2006)  بزراعة مستأصلات من نبات Alstroemeria cv Yellow King في بيئة MS ونصف وربع تركيزها بغرض تكشف الأشطاء. وقد كان أعلى معدل لإنتاج الأشطاء عند استعمال نصف تركيز البيئة. لكن كان أطول الأشطاء عند استعمال ثلاثة أرباع التركيز. ولم يتأثر تكوين الجذور باختلاف تركيز الأملاح، وعلى العكس من ذلك أشار (2000) .Mohamed et al أن نصف تركيز أملاح MS أفضل من التركيز الكامل لتجذير أشطاء نباتات Tagetes minuta.

بيئة (Gamborg (B5

تم تركيب هذه البيئة بواسطة (1976) Gamborg لنمو معلق خلايا نبات Glycine max ويتضح أنها تحتوى على تركيز منخفض من NH₄⁺ حيث يُثبط نمو الخلايا إذا احتوت البيئة على تركيز 2 مليمول من NH₄⁺. كما اختلف تركيز Ca²⁺/Mg²⁺ ليتراوح بين 1 و 4 مليمول. وتعد بيئتي MS و B5 من أكثر البيئات استعمالاً في زراعة الأنسجة بنفس التركيب أو بعمل تحويرات قليلة في محتوياتهما. ومن المهم التأكيد على أن تركيز الأيونات المختلفة في البيئة له نفس أهميه نسبة هذه الأيونات لبعضها البعض بالإضافة للتركيز الكلى من الأيونات كما إن امتصاص الأيونات المعدنية يتوقف على نسبة سطح المُستأصل النباتي الملامس للبيئة إلى السطح الكلى وما إذا كانت البيئة سائلة أو صلبة. فالجزء الكبير نسبياً من الكالس تكون نسبة سطحه الملامس للبيئة صغيرة بالمقارنة مع حجمه الكلى. وضبط تركيز الأيونات يصبح أكثر أهمية عندما يكون أيون ما مثبط للنمو أو لإحدى العمليات الفسيولوجية لنوع نباتي معين، فعلى سبيل المثال الأنواع الخشبية تنمو بدرجة أحسن عندما يكون تركيز الأملاح الكلي في بيئة MS منخفض لذا يفضل استخدام نصف التركيز. وقد يتحسن النمو عند خفض أيون معين أو أكثر لكن بالطبع يكون هذا محل تجريب لكل نوع نباتي على حده.