العوامل المؤثرة على النمو والتكشف في مزارع الأنسجة (العوامل المتعلقة بالمستأصل النباتي)

بفرض ثبات باقي العوامل المتعلقة بالنبات الأم والظروف البيئة فإن هناك الكثير من العوامل المتعلقة بالمُستأصَل النباتي نفسه والتي تؤثر على استجابته في زراعة الأنسجة وهذه العوامل هي:

1. عمر المُستأصل النباتي

يقاس عمر المستأصل النباتي بعمر العضو النباتي المأخوذ منه هذا الجزء أو عمر النبات الأم، وذلك اعتبارا من تكوين الزيجوت أو تفتح البرعم المكون للنبات. والمقياس الآخر للعمر، هو العمر الفسيولوجي للعضو. وأصغر الأجزاء النباتية عمراً هي الأنسجة الغير متكشفة أي الأنسجة الميرستيمية، أما الخلايا المتكشفة الناتجة منها فهي أكبر عمراً. ونظريا فإن الأنسجة الميرستيمية يمكن أن تظل على هذه الحالة أي في مرحلة الصبا إلى ما لانهاية لو تم فصل القمم النامية وزراعتها ودفعها إلى تكوين الجذور باستمرار في المعمل. وفي دراسة لتأثير عمر المُستأصل النباتي على التكشف فصلت منطقة epicotyl وهي تلك الواقعة أعلى الأوراق الفلقية وأسفل الأوراق الحقيقية من بادرات Vigna mungo عمرها يتراوح بين 3 و 17 يوم. ويبين (2002 ,.Saini et al) أن الأشطاء قد تكونت  من كلا طرفي المُستأصل النباتي عندما أخذ من بادرات عمرها ثلاثة أيام. وتكشف عدد أكبر الأشطاء في القاعدة المنغمسة في بيئة النمو بالمقارنة مع العدد المتكشف من القمة. لكن تكشفت الأشطاء على الطرف العلوي فقط للمُستأصلات الأخرى، ومع هذا لم يكن هناك فرق معنوي في عدد الأشطاء الكلى بصرف النظر عن عمر المُستأصل كما هو مبين في جدول رقم (1). كما تأثر عدد الأشطاء المتكشف بعدد آخر من العوامل الخاصة بالمستأصل النباتي ستناقش لاحقاً.

وبعد تكوين المزرعة يمكن استخدام النباتات أو الأنسجة الناتجة كمصدر جديد لمزرعة جديدة أو ما يسمى بـ subculture. ويؤثر عمر المزرعة قبل استعمالها كمصدر للمزرعة الجديدة على استجابتها فقد استخدم (2004) .Quraishi et al مُستأصلات من تاج أشجار Azadirachta indica، أو من البراعم القاعدية المتفتحة حديثة النمو على قاعدة الأشجار، وكذلك من بادرات حديثة الإنبات. وقد لاحظ فرق في قدرة هذه المُستأصلات على النمو إنتاج الأشطاء. وكان من الضروري استعمال PVP للتغلب على المواد الفينولية في حالة استعمال مستأصلات من أشجار بالغة وعلى الرغم من ذلك ماتت المُستأصَلات التي جمعت من التاج بعد تجديد زراعتها للمرة الثالثة في حين تكونت جذور على المُستأصلات الأخرى. وغالباً للأنسجة المأخوذة من نباتات صغيرة العمر أو أعضاء حديثة التكوين قدرة أعلى على النمو والتكشف في زراعة الأنسجة سواء بالطريقة المباشرة أو غير المباشرة (1993 George,). وقد تظهر كالسات العديد من الأنواع النباتية قدرة أعلى على النمو والتكشف لمدة طويلة تحت ظروف معينة لكنها تفقد هذه القدرة بعد فترة من زراعتها في القوارير. ويرجع ذلك إلى أسباب مازالت قيد البحث وغير معروفة تماماً إلا أن هناك عدة نظريات لتفسير ذلك وهي:

أ. التباين الوراثي: عادة يتم انتخاب الخلايا ذات القدرة على النمو في المزرعة لكن قد لا يتفق هذا مع القدرة على التكشف. ولذا قد يؤدى انتخاب الخلايا ذات القدرة العالية على النمو إلى فقدان الخلايا ذات القدرة على التكشف.

جدول 1: تأثير عمر المُستأصل النباتي على تكشف الأشطاء في نباتات Vigna mungo كما وجدها (2002) .Saini et al.

ب. وجود مواد مشجعة على التكشف: قد تحتوي الأنسجة حديثة الزراعة على مواد مشجعه للنمو والتكشف وباستمرار زراعتها يحدث نقص في التركيز الضروري لذلك. أو قد تتراكم مواد مثبطة للنمو والتكشف أثناء مراحل الزراعة السابقة. وقد أكد (1997) .Blanco et al هذه الفرضية في دراسة لإكثار إحدى سلالات قصب السكر عن طريق الأجنة الجسدية حيث لاحظ انخفاض في المحتوى الكلى للبروتين في الكالس، وارتبط ذلك بالقدرة على تكشف النباتات. فبعد ستة أشهر من الزراعة تم فيها إعادة الزراعة تسع مرات فقد الكالس القدرة على التكشف حيث انخفض البروتين الكلى من 5.1-4.7 ملجم/ جرام طازج من الكالس إلى أقل من 0.1 ملجم على أساس نوع الأوكسين المستعمل. ويشير التحليل الكهربي للبروتين المستخلص من الكالس إلى وجود بروتين محدد تراوح وزنه على أساس نوع الأوكسين المستعمل بين 55 و 67 كيلو دالتون. وسجل وجود هذا البروتين بعد نقل الكالس إلى بيئة التكشف بيوم واحد وقد ارتبط وجود هذا البروتين بالقدرة على التكشف.

ج. التغيرات الوراثية: رغم احتفاظ الخلية بمعلوماتها الوراثية الضرورية للتكشف إلا أنه من الضروري المحافظة على آلية العمل المنظم لهذه المنظومة والتي قد يحدث لها فقد باستمرار الإكثار أو تصبح غير فعالة نتيجة حدوث تغيرات وراثية ترجع إلى الظروف البيئة وهو ما يعرف بالتغيرات الوراثية الجسدية سواء الوراثية أو فوق الوراثية. وباستخدام الوراثة الجزيئية يبين (Deng & Hao (2002 أن كالسات البرتقال تفقد قدرتها على تكوين الأجنة الجسدية بعد عدة مرات من تكرار زراعتها نتيجة لبعض العوامل الوراثية وفوق الوراثية. ويمكن للكالس استعادة تلك القدرة عند تعرضه لبعض صور الإجهاد البيئة مثل الحرارة المنخفضة أو التجفيف. ولارتباط مجاميع الميثل بالحامض النووي دور كبير في هذه الظاهرة. لكن درس (2006) .Zhang et al معدل التضاعف الكروموسومي في العديد من أصناف الحمضيات أثناء زراعتها في القوارير ولم يجد ارتباط بين معدل التضاعف الحادث وقدرة الخلايا على التكشف أو طول مدة الزراعة لكن فقد 26 طرز وراثي من بين 35 طرز تم دراستها القدرة على تكوين الأجنة الجسدية بطول فترة الزراعة.

2. موقع وحجم المُستأصل النباتي

تتباين قدرة الأنسجة المختلفة المأخوذة من نفس العضو النباتي على النمو والتكشف في زراعة الأنسجة وتعرف هذه الظاهرة باسم Topophysis. وهذا المصطلح مشتق من الكلمة اللاتينية Topos والتي تعنى المكان وكلمة Physis والتي تعنى طبيعة Nature. وتختلف استجابة الأجزاء المأخوذة لمنظمات النمو ومكونات البيئة الأخرى على أساس مكان وجودها في العضو المأخوذة منه وربما يتعدى هذا التأثير إلى مرحلة ما بعد النقل من المعمل. ليس هناك تفسير دقيق لهذه الظاهرة (1993 ,George). قام (2009) Papafoticu & Martini بزراعة مستأصَلات ورقية من خمسة مناطق لأوراق Zamioculcas zamiifolia كما في الشكل المبين في عدة أوساط نمو. وفى البداية لم يشاهد اختلاف بين المُستأصلات إلا أنه بعد الأسبوع الثالث بدأت الأجنة الجسدية في التكشف من المُستأصل الأول والثاني وبمعدل عالي. وكان أعلى معدل لتكوين الأجنة للمُستأصل المفصول من الموقع الأول عند إضافة 2,4-D فقط للبيئة أما المُستأصل المفصول من الموقع الثاني فكانت أفضل استجابة له عند إضافة BA إلى البيئة. أما المُستأصلات التي فصلت من قمة الورقة والتي لم تتضمن جزء من العرق الوسطى فكانت استجابتها منخفضة جداً. وترجع بعض التفسيرات تأثير مكان المُستأصل إلى دور بعض منظمات النمو مثل الأوكسينات والسيتوكينينات وربما حامض الأبسيسك لكن يعتقد أن الدور الكبير يرجع إلى السيتوكينينات، حيث أشار (2009) Papafotion & Martini إلى تحسن في استجابة المُستأصَلات البعيدة عن العرق الوسطى بإضافة السيتوكينين للبيئة.

وفي دراسة قام بها (1999) .Bredmose et al لتوضيح أثر هذه الظاهرة في إكثار بعض هجن الورد باستعمال البراعم الجانبية، تم أخذ عقل ساقية كل منها يتكون من برعم واحد في إبط ورقة مكونة من خمس وريقات على الأقل، بحيث تم أخذ تسع عقل من نفس الساق وبترتيب من 1 إلى 9 متجها من القمة إلى القاعدة. ولاحظ أن أغلب العقل الثلاثة القاعدية لم تتكشف براعمها أو تكشفت لكنها لم تنتج أزهار لإجهاض البرعم الزهري في مراحل تكونه الأولى. وكان أيضاً لموضع العقل تأثيرا في بعض الصفات فقد زادت المدة اللازمة من الزراعة حتى بدء نمو البرعم وكذلك الفترة السابقة لتكوين البرعم الزهري وطول الحامل الزهري بالاتجاه إلى أسفل، لكن لم يكن هناك فرق في قطر الأزهار ولا عمرها بعد القطف وتختلف استجابة الأجزاء المختلفة المنزرعة من الجزء النباتي لمكونات البيئة والظروف البيئية للزراعة، ففي تجربة أخرى لدراسة تأثير عدة توليفات من منظمات النمو على التكشف العرضي لبراعم نبات التيوليب وذلك بزراعة أجزاء مأخوذة من مواضع مختلفة من الحامل الزهري، أوضح (1980) Wright كما هو مبين في شكل رقم (1) أن عدد الأشطاء المتكشفة تتأثر بموضع المُستأصل النباتي ونوع وتركيز منظمات النمو المستعملة بالإضافة إلى التداخل بينهما.

هناك غالبا حجماً مثل للمُستأصل النباتي المناسب للزراعة، فالأجزاء الصغيرة جدا سواء أكانت نسيج أو قمة ميرستيمية أو كالس تموت عند زراعتها. أما الأجزاء الكبيرة نسبياً فتكون صعبة التعقيم وكذلك يكون السطح المقطوع أقل نسبيا وبالتالي يقل امتصاص مكونات البيئة، ويؤثر حجم المُستأصل النباتي على نسبة السطح الملامس للبيئة. لكن يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن الزيادة النسبية في امتصاص مكونات البيئة لا تعنى زيادة معدل النمو والتكشف. فعند تقسيم الجزء الطرفي من ساق نبات Lilium longiflorum إلى أجزاء بسمك يتراوح بين 0.5 إلى 3 مم وزراعتها في بيئة تحتوي على نصف تركيز مكونات بيئة MS مع الاحتفاظ بنفس الاتجاه المورفولوجي للأجزاء المنزرعة. أوضحت النتائج أن الأجزاء ذات السمك 0.5 مم كانت حيويتها منخفضة (5%) أما الأجزاء ذات السمك الأكبر فكانت نسبة بقائها حية أعلى وتتراوح بين 80-100 %، لكن لم تتكون أشطاء في كل الحالات. وبإضافة الفحم المنشط بمعدل 1 جم /لتر تحسنت نسبة بقاء الأنسجة الحية وتكونت أشطاء وكان أعلى معدل لتكوين الأشطاء 4.1 / جزء نباتي عندما استعملت أجزاء ذات سمك 1 مم (كانت مدة الزراعة 45 يوم). وعندما قسمت الساق إلى أجزاء سمكها 1مم كانت نسبة حيوية الأجزاء العلوية منها (1-5) مرتفعة وتصل إلى 100 % وانخفضت هذه النسبة إلى 85، 70% على التوالي للجزئيين التاليين. كما انخفض معدل تكوين الأشطاء من 5.8 / جزء نباتي إلى فرع واحد فقط لكل جزء نباتي بعد 60 يوم من الزراعة (2001 ,.Nhut et al). وفي معلق الخلايا يلاحظ أن هناك حد أدنى من الكثافة الخلوية الضرورية لنمو الخلايا.

شكل 1: يوضح تأثير التداخل بين مصدر المُستأصل النباتي ومنظمات النمو على عدد الأشطاء الناتجة لكل جزء نباتي مأخوذ من ساق زهرية طولها 22مم لنباتات لصنف Merry widow من التيوليب Wright, 1980)).

3. طريقة زراعة المستأصل النباتي

وهي تعنى اتجاه وضع المُستأصل النباتي في البيئة شبة الصلبة أو البيئة السائلة الثابتة، أما البيئة السائلة المتحركة فلا يمكن المحافظة على اتجاه محدد للمستأصل. فالأجزاء المأخوذة من الأوراق مثلا إما أن توضع على سطح البيئة بحيث يكون السطح السفلى أي القاعدة الظاهرية ملامس للبيئة أو توضع بطريقة عكسية. وكذلك بالنسبة للأجزاء المفصولة من السيقان فقد توضع بحيث يكون الجزء القريب من القمة النامية أي القمة الظاهرية متجها إلى أعلى أو العكس، أما القمة الظاهرية للجذور فهي الجزء القريب من القمة النامية. ومن المعروف من دراسات علم وظائف النبات أن هناك فرق جهد بين القمة الظاهرية والقاعدة الظاهرية النسيج النباتي. ويرجع ذلك لتأثير وجود أيون الهيدروجين حيث يعمل الأوكسين والبوتاسيوم على حركه أيون الهيدروجين إلى الطرف العلوي من الخلية وبذلك تصبح الخلية ذات شحنة موجبة في الطرف العلوي وشحنة سالبة في الطرف السفلى، أما الخلية الموضوعة أفقياً فهي ذات شحنة موجبة في الناحية العليا وسالبة في الناحية السفلى ويبين شكل رقم (2) مدى تأثير زراعة العقل الساقية للقرنفل المحتوية على برعم واحد على التكشف العرضي للأشطاء، كما يلاحظ تكوين الكالس على الطرف السفلى للمُستأصل عند زراعته مقلوباً.

شكل 2: العقل الساقية للقرنفل منزرعة في وضع مقلوب (يمين) ووضع طبيعي (يسار).

لكن يوضح (2006) .Garciá-Luis et al عدم وجود دور للجاذبية الأرضية المتعلق بطريقة توجيه المُستأصل على مسلك التكشف لمُستأصل بادرات نبات Troyer citrange وهو أحد الأصول المستعملة لإكثار الحمضيات. وقد تأثر معدل تكوين الكالس وعدد الأفرع المتكشفة على القطبية وطرف المُستأصل ملامس للبيئة. فبزراعة المُستأصل أفقيا تكون الكالس على كلا الطرفين لكنه كان أكبر عند القاعدة، ورغم انه لم يسجل فرق في عدد البراعم على كلا الطرفين فإن عدد أكبر من الأشطاء تكون على القمة. لكن عند زراعة المُستأصل عموديا تكون الكالس على الطرف الملاصق للبيئة بصرف النظر عن نوعه، وتكشفت الأشطاء مباشرة من القمة إن لم تكن ملامسة للبيئة فإن كانت هي المنغمسة في البيئة تكون الكالس قبل تكشف الأشطاء. وقد أضاف أن تكوين الكالس ارتبط بتركيز السيتوكينين لكن على العكس من ذلك لم يكن تكشف الأشطاء على القمة غير الملامسة للبيئة بسبب السيتوكينينات . وذلك لأنه لم يمكن استحثاث تكشف الأشطاء على قاعدة المُستأصل البعيدة عن البيئة والمنزرع في وضع مقلوب بالمعاملة الموضعية بنفس التركيز من السيتوكينينات الذي أضيف للبيئة لاستحثاث تكوين الأشطاء. وتكشف الأشطاء بطريقة غير مباشرة على القاعدة الملامسة للبيئة وبزراعة المُستأصل مقلوب حتى لا تلامس القاعدة البيئة وقف التكشف، ويبين ذلك دور القطبية وملامسة المُستأصل للبيئة.

عادة يُظهر المُستأصل النباتي نوعاً من القطبية أثناء النمو والتكشف، ويرتبط ذلك بطريقة وضع النسيج في المزرعة واتجاه وضع الأوعية المحتوية على المزرعة . وفي معظم الحالات يتم تكوين الأشطاء من القمة الظاهرية للجزء المنزرع سواء السيقان أو الجذور أما الجذور فتتكشف من القاعدة الظاهرية أي الجزء الأقرب للجذور من المُستأصلا لنباتي ويطلق عليها proximal. وقد درس (2006) .Newell et al تكشف الجذور على عقل نباتات Lens culinaris حيث زرع العقل رأسياً في البيئة في الوضع الطبيعي أو المقلوب، وقارن ذلك بوضع انابيب الزراعة المحتوية على الاجار في وضع مقلوب بعد الزراعة كما في جدول رقم (2) . ولمعرفة تأثير التهوية قام بزراعة العقل في الوضع الطبيعة أو المقلوب في بيئة استبدل فيها الآجار بخليط من البيت موس والبيرليت والرمل الخشن.

ويتضح من الجدول أن الجذور تكشفت على قاعدة العقل حتى تلك التي زرعت مقلوبة لكن كان لتأثير التهوية دور مهم حيث كان معدل تكشف الجذور أعلى على القاعدة الموجودة بعيداً عن البيئة أو تلك التي زرعت في تربة تضمن التهوية بصرف النظر عن اتجاه العقلة.

جدول 2: تأثير اتجاه الزراعة والتهوية على تجذير عقل Lens culinaris كما لاحظها (2006) .Newell et al .

وتتكون الأشطاء غالباً على السطح العلوي أو الجزء البعيد من عنق الورقة عند زراعة الأجزاء الورقية أما الجذور فتتكون على السطح السفلى أو الجزء القريب من الساق. وبتقسيم العضو الواحد إلى عدة أجزاء متساوية فإن بعض الأجزاء بصرف النظر عن موضع النسيج في ذلك العضو يكون لها قدرة أعلى على النمو والتكشف دون غيرها على أساس الشحنة الموجودة على النسيج. وتؤثر منظمات النمو المختلفة خاصة IAA على اتجاه القطبية في المُستأصل النباتي بسبب حركتها القطبية من أعلى إلى أسفل. وربما تكون القطبية غير واضحة في حالة الأنسجة صغيرة الحجم لكنها تزيد بزيادة حجم النسيج.

وكما أن لاتجاه وضع المُستأصَلا لنباتي تأثير على القطبية فإن وضعه فوق أو داخل البيئة له تأثير على النمو والتكشف. وقد يعزى ذلك إلى القدر المتاح من مكونات البيئة ومنظمات النمو كما أشار (2009) Papafotiou & Martini في دراسته على نباتات Z zamiifolia. حيث يبين أن وضع المُستأصلات عمودياً يقلل من تكون الأجنة الجسدية بالمقارنة مع الزراعة الأفقية. وقد درس (2000) .Orlikowska et al تأثير وجود الأوراق والقمة النامية للأفرع أو إزالتها من الجزء المستعمل للزراعة في نباتات الكروتون Codiaeum variegatum مع وضع المُستأصلا لنباتي في نفس اتجاه النمو الطبيعي أو أفقيا أو وضعه مقلوباً بحيث تكون القمة النامية إلى أسفل. لكن هذا الاتجاه الأخير لم يتمكن من المحافظة عليه طول فترة التجربة، حيث أدى تكوين الأوراق إلى خلل في هذا الوضع وجعل المُستأصل النباتي يأخذ وضعا أفقيا بعد فترة من الزراعة. وتوضح النتائج بجدول رقم (3) تأثير هذه المعاملات على معدل التكشف للأشطاء وطول الأشطاء المتكشفة، ويتضح أن إزالة الأوراق والقمة النامية ووضع النسيج أفقيا أعطت أفضل النتائج.

جدول 3: تأثير إزالة الأوراق والقمة النامية واتجاه وضع النسيج لنبات Codiaeum variegatum على نمو البراعم الجانبية (2000 ,.Orlikowska et al).

4. التنافس بين الميرستيمات المتكونة في المُستأصل النباتي

يؤدى ارتداد بعض خلايا المُستأصل النباتي إلى الحالة الميرستيمية عقب الزراعة إلى تثبيط تحول الخلايا الأخرى للحالة الميرستيمية. وتزيد هذه القدرة بزيادة حجم النسيج الميرستيمي، حيث ترسل خلايا هذا النسيج إشارات يعتقد أنها عبارة عن اكسينات إلى الخلايا الأخرى لتثبط ذاك التحول. وبالتالي يلاحظ أن البراعم العرضية الحديثة تعمل على تثبيط تكوين أخرى جديدة، ومن ثم يجب إزالة الأشطاء المتكونة لدفع المُستأصل النباتي إلى تكوين أشطاء جديدة وكذلك الحال للأجنة الجسدية Preece (2008). وقد استدل ببعض الملاحظات على نبات Picea abies فبالرغم من تكشف 10-30 برعم عند زراعة الأجنة فإن ثلاثة أشطاء فقط استطالت إن لم يتم فصل الأشطاء التي وصل طولها إلى 3-5 مم تقريباً وبذلك استطالت باقي البراعم تباعا، وبالمثل لم تستطيل أشطاء Pinus radiata إن لم يتم تقسيم المناطق الميرستيمية وإبعادها عن بعضها البعض. وتختلف شدة هذه الظاهرة باختلاف الأنواع النباتية ومدى التداخل بين العوامل الوراثية ومكونات البيئة وخاصة منظمات النمو.

5. الجروح

في الظروف الطبيعة تؤدى عمليات التقليم والرعي الجائر، والضرر الميكانيكي إلى تشجيع نمو الكالس على الأنسجة المقطوعة أو تشجيع نمو البراعم الساكنة وكذلك تكوين براعم عرضية في بعض النباتات وبالطبع أثناء زراعة الأنسجة يتعرض المُستأصلا لنباتي إلى عدة صور من التجريح وكلما كان المُستأصل النباتي صغير كانت مساحة السطح المقطوع منسوباً للسطح الكلى كبيرة وبالتالي يزيد أثر التجريح. وقد يعزى التغيير الحادث في المُستأصَلا لنباتي بعد ذلك إلى المواد المخلقة منه كغاز الإثيلين. هذا وقد سبق مناقشة التأثير الفسيولوجي للتجريح على الأنسجة المنزرعة باستفاضة في الفصل الخاص بمنظمات النمو إلا أنه قد يكون من المفيد الإشارة إلى دراسة (2009) .Zeng et al على أشجار Citrus reticulate حيث قام بزراعة مستأصلات مفصولة من البادرات بعد شقها طولياً أو بدون شقها. وقد وصلت نسبة المُستأصلات التي تكشفت إلى 100% وبمعدل 13.2 برعم للمُستأصل الواحد في مقابل 65% وبمعدل 6.7 عند عدم شق المُستأصَلات. وفي كلا الحالتين تم التكشف بطريقة مباشرة أو غير مباشرة من الكامبيوم الحزمي ومن ثم يتبين أن إحداث الجروح في الكامبيوم استحث الخلايا للتكشف. ويعتقد أن هذه الطريقة قد تكون بمثابة حل لتكشف الأشطاء في النباتات التي يصعب زراعتها في القوارير ولعل إحداث تجريح للمُستأصل النباتي هو من مستلزمات التحول الوراثي عند استخدام Agrobacterium كوسيط لنقل الجينات.