تخفيف السائل المنوي للماشية وحفظه

بدأ التفكير في طرق حفظ السائل المنوي مع ظهور التلقيح الصناعي، وعن المدة من الوقت اللازمة لحفظ السائل المنوي خارج جسم الطلوقة الذي نحصل عليه. وقد أوضح E.E. IVANOV أن ظروف حفظ السائل المنوي لابد أن تكون مختلفة تبعا للمدة المطلوبة للاحتفاظ به، ففي حالة حفظه لمدة قصيرة لابد من مراعاة الظروف التالية: أوعية وأجهزة نظيفة، وتجنب تعرض السائل المنوي لأشعة الشمس المباشرة ودرجة الحرارة من 18-25 م، أما في حالة حفظه لمدة طويلة فلابد من حفظه في درجة 196 م تحت الصفر.

واتضح أن الحيوانات المنوية تختلف عن خلايا الجسم الأخرى حيث تتفوق عملية الاختزال على عملية أكسدة الغذاء، ونتيجة لذلك يحدث نسبيا سرعة في استهلاك احتياطي المواد الغذائية الخاصة للحيوان المنوي مما يؤدى إلى نفوقه.

وسبب آخر لنفوق الحيوان المنوي عند تخزينه خارج الجسم هو التسمم بحامض اللاكتيك ونواتج التحلل الأخرى، وتحت هذه الظروف وقبل حدوث النفوق يفقد الحيوان المنوي القدرة على إخصاب البويضة ، كما يتوقف بقاء الحياة للحيوانات المنوية على قدرتها على الحصول على غذائها من الوسط المحيط بها وحجم مصادر الحياة وسرعة استهلاكها، وكلما زاد معدل التمثيل الغذائي للحيوانات المنوية كلما أدى ذلك إلى سرعة نفوقها ولذلك فلإطالة حياتها لابد من توفر عاملين:

(1) التغذية والرعاية الجيدة للطلايق التي ترفع من قدرة الحيوانات المنوية على الحياة.

(2) الطريقة التي تؤدى إلى بطء التمثيل الغذائي. ولأجل بطء عمليات التمثيل الغذائي أمكن اقتراح طرق مختلفة وذلك بإضافة فلوريك صوديوم Fluoric وحامض كربونيك لتغيير الظروف الحرارية.

وفى الوقت الحالي الطريقة الأكثر انتشارًا لحفظ السائل المنوي تحت درجة حرارة الثلج، وهذه الطريقة تُستخدم في مجالات الإنتاج حيث أن الثلج رخيص الثمن ووسيلة للتبريد شائعة وهى أيضًا مناسبة فعند ذوبان الثلج تبقى درجة الحرارة في مستوى واحد.

ولكي نتجنب صدمة البرد تستخدم طريقتان:

الطريقة الأولى: تتلخص في إجراء التبريد بالثلج بالتدريج وفي مستوى واحد حتى تكون سرعة التبريد طوال الوقت حتى يكون انخفاض درجة التبريد وسرعتها طول الوقت في مستوى واحد، وبمعنى آخر أن السائل المنوي يحدث له تبريد نسبي بسرعة واحدة، ونتيجة لذلك لا يحدث تراكم من حامض اللاكتيك وتخلفات من نواتج أخرى، ومع الاقتراب من درجة الصفر يحدث التراكم ببطء ومثالاً لذلك: في الساعة الأولى ومع درجة حرارة السائل المنوي تنخفض من 40 م إلى 20 م (الانخفاض 20م)، وفى الساعة الثانية من 20 إلى 10°م (أي الانخفاض 10 م) ، وفى الساعة الثالثة من 10 - 5  (أي 5 م)، وفي الساعة الرابعة من 5 م إلى 2.5م (أي الانخفاض 2.5م) وفى الساعة الخامسة تصل إلى الصفر.

والرقم الذي يُعبر عن الانخفاض في درجة الحرارة في السائل المنوي في كل ساعة يسمى معامل التبريد C) coefficient of cooling) ، وكلما تم التبريد ببطء كلما قلت خطورة صدمة التبريد، ولكن لأجل السائل المنوي للطلوقة لا يسمح باستخدام التبريد الزائد في الانخفاض حيث في هذه الحالة يتراكم كثير من حامض اللاكتيك مما يؤدى إلى تسمم الحيوانات المنوية، وفى هذه الحالة كلما كان السائل المنوي كثيفا كلما أدى إلى سرعة تراكم حامض اللاكتيك، ولذلك تستخدم السرعة في التبريد التي بها نتجنب كلا الخطرين وهما صدمة التبريد وسرعة الأكسدة.

وقد أوضح ميلافانوف أن السائل المنوي الكثيف غير المخفف للطلوقة يمكن تبريده باستخدام معامل التبريد 1.8 إلى 2.2 حيث أن درجة حرارة السائل المنوي تنخفض إلى الصفر في فترة 6-8 ساعات، ويُستخدم أكبر معامل تبريد عالي للسائل المنوي الأكثر كثافة، وتُستخدم طريقة أخرى تعتمد علي صفة تفاعل Lecithine مع البروتين الذي يحتفظ به الحيوان المنوي نتيجة لصدمة البرودة، والـ Lecithine بكمية كبيرة (تصل إلى 7 %) موجود في صفار البيض Yolk ، ويخفف السائل المنوي قبل التبريد بمخفف معين الذي في تركيبه علاوة على الماء المقطر يدخل أيضًا في تكوينه صفار بيض الدجاج الطازج وسترات الصوديوم والجلوكوز، ومع احتواء المخفف على 20٪ صفار البيض يمكن تبريد السائل المنوي بمعامل تبريد 20-25 م أي يمكن بغمس قارورة بها السائل المنوي في الثلج، وتعتبر سترات الصوديوم مخفف قلوي ويتعادل مع حموضة الصفار، ويعتبر الجلوكوز مادة غذائية للحيوانات المنوية.

ويقوم المخفف صفار البيض بالحماية في لحظات سريعة وخلال بعض الدقائق بعد التخفيف، ولذلك لا يُنصح بتخفيف السائل المنوي بمخفف بارد ويتم حفظ السائل المنوي ذو الصفات العالية وتقديره لا يقل عن 0.8.

طريقة تخزين السائل المنوي :

التخزين لفترة قصيرة وتخفيف السائل المنوي في درجة حرارة الصفر

قبل استقبال السائل المنوي من الطلوقة يحضر المخفف من صفار البيض حسب الوصفة التالية:

ماء مقطر                         100 مللي لتر

جلوكوز طبي (بدون ماء)    3 جم

سترات الصوديوم              4.1 جم

صفار بيض الدجاج             20 مللي جرام

ولكل 100 مللي جرام مخفف تضاف مواد مقاومة للبكتريا بالكميات التالية:

مضاد للبكتريا الأبيض streptothricin 150 مللي جرام، بنسلين صوديوم 30000-50000 وحدة، ستربتوماسين 30000 - 50000 وحدة، وفي البداية يُذاب في الماء الجلوكوز وسترات الصوديوم والمضادات الحيوية ثم يضاف صفار البيض، ويلزم الحرص في التحضير حتى لا يحدث ترسيب لبروتين بيض الدجاج في المحلول. ويمكن استبدال المخفف باستخدام لبن بقرى مغلي خلال 1 - 2 دقيقة ويبرد إلى درجة حرارة 30 - 35 م، وفى كل 100 مللي لتر لبن يضاف 20 مللي لتر صفار البيض، ولابد أن تمر فترة لا تزيد عن 5 - 7 دقائق من وقت الحصول على السائل المنوي إلى تخفيفه.

وقبل استخدام المخفف لابد أن يسخن في ماء دافئ إلى درجة حرارة 30 - 35 م، ومع إجراء التخفيف لابد أن يصب المخفف في السائل المنوي وليس العكس، ويخفف السائل المنوي للطلوقة طبقا لصفاته بنسبة من 1: 3 إلى 1 : (15-20) ويمكن أيضًا بنسبة تصل إلى 1 : 50 ( في أغلب الأحوال بنسبة 1 : 8 - 10) ، وبعد التخفيف يفحص السائل المنوي تحت الميكرسكوب، وإذا خفض المخفف من نشاط الحيوانات المنوية فلابد من استبعاد المخفف وتحضير مخفف جديد.

ويصب السائل المنوي المخفف في أنابيب اختبار نظيفة جافة معقمة التي تقفل جيدا بغطاء محكم من المطاط، ونضع تحت أنبوبة الاختبار صفحة من الورق المقوى، وكل إناء تلصق به قطعة من الورق label أو القماش لتوضح محتويات الإناء من المخفف والتاريخ وساعة الحصول على السائل المنوي وحجمه، وتوضع الأوعية وبها السائل المنوي المخفف في ترامس غذائية أو ترامس خاصة بذلك، وتملئ قبل وضع الأوعية بقطع صغيرة من الثلج، ولابد من وضع الأوعية وبها السائل المنوي في الترموس خلال 15 دقيقة من لحظة الحصول عليه ولا يُنصح بالتأخير عن ذلك حيث أن وجود الترموس في درجة حرارة الغرفة يؤدى إلى تراكم نواتج ضارة متخلفة عن عملية التمثيل الغذائي (الشكل التالي) ومع ذوبان الثلج نتخلص من الماء ويضاف الثلج بدلا منه، وفي حالة نقل السائل المنوي شتاءً يجب حماية الترموس بغطاء من اللباد أو حشوة من قطن أو ورق مقوى حيث أن الحيوانات المنوية تموت إذا كانت درجة حرارة الثلج - 1 م، ويمكن انتقال التراموس وبها السائل المنوي على أي وسيلة انتقال، ولأجل حفظ السائل المنوي من تكوين رغاوى لابد من صب السائل المنوي في قوارير حتى الغطاء.

ويمكن حفظ الحيوانات المنوية في درجة حرارة الصفر وتحتفظ بالخصوبة خلال 2-3 أيام ولذلك لابد من فحص السائل المنوي تحت الميكرسكوب في درجة حرارة 37 - 40 م.

حفظ السائل المنوي غير المخفف لفترة قصيرة في درجة حرارة الصفر المئوي:

يمكن إجراء ذلك باستخدام إناء ذو جدارين خاص بحفظ السائل المنوي، ففي البداية يتم ملء جسم الإناء الخارجي بالماء الدافئ (30-35 م) ثم نضع السائل المنوي، ويُغطى بغطاء محكم زجاجي ثم تُلف جميع جوانب الإناء الخارجي باللباد بسمك 2-3 سم، ثم يوضع في إناء زجاجي حجمه 0.5 - 0.7 لتر، ويُقفل الإناء الداخلي بغطاء ويُغمس في الثلج أو الجليد، وبهذا الإجراء نحافظ على حركة الحيوانات المنوية بمقدار 0.6 ( 60%) في خلال 1 - 1.5 يوم.

حفظ السائل المنوي في حامض الكربونيك المشبع

وقد اقترحه العالم الأمريكي فأندى مارك الذي استخدمه لأجل وقف أو إخمار تكوين ثاني أكسيد الكربون نتيجة عملية التمثيل الغذائي، ويستخدم الخليط التالي:

ماء مقطر                       100 مللي لتر

سترات صوديوم              2.4 جم

جلوكوز                           0.3جم

بيكربونات الصوديوم         0.21 جم

کلورید بوتاسيوم              0.04 جم

مضاد حيوي streptocid   0.3 جم

صفار بيض                       10 جم

ومن خلال المخفف في خلال 10 دقائق يضاف ثاني أكسيد الكربون، ثم يضاف على مقدار واحد مللي لتر من المخفف 1000 وحدة بينتسلين و 0.1 مللي لتر سلفات دهیدرو ستربتوميسين، ويخفف السائل المنوي بنسبة 1 : (10-40)، ويُوضع بإحكام في أنابيب زجاجية ويحفظ في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة، وفى خلال 5-6 يوم تبقى خصوبة السائل المنوي عالية ونسبتها حوالى 60 - 70٪.

حفظ السائل المنوي لفترة طويلة بواسطة التبريد العميق:

مع تكوين محطات التلقيح الصناعي أصبح من الضروري التفكير في وسائل حفظ السائل المنوي التي تسمح بحفظه محتفظا بصفة الخصوبة ولو في خلال 2-3 أسبوع، ونظرا للحاجة إلى توفر احتياطي من السائل المنوي يوزع على مزارع أخرى، ويوفر التكاليف الباهظة لاقتناء الذكور للتلقيح، كما بذلت محاولات لإيجاد أحسن طريقة لضمان سلامة انتقال السائل المنوي والاستفادة من السائل المنوي الزائد عن حاجة محطة تربية الأبقار والاستفادة منه في تلقيح إناث في مزارع أخرى يصعب انتقال الذكور إليها أو حدوث تكدس في عدد الإناث التي في حالة شبق ومطلوب سرعة تلقيحها.

شكل يبين إناء حفظ السائل المنوي.

وقد ثبتت إمكانية العمل على إطالة مدة حفظ السائل المنوي عن طريق انخفاض درجة الحرارة أثناء حفظه، ولكن اتضح أنه عند درجة الحرارة - 0.6 يبدأ السائل المنوي يتجمد وبعد إزالة التجمد تفقد الحيوانات المنوية صفة الخصوبة، وسبب نفوق الحيوانات المنوية عند التجمد هي نفس الأسباب التي تسبب موت النباتات في وقت الشتاء القارس نظرا لموت الخلايا النباتية في حالة تجمدها وذلك لإزالة الماء من البروتوبلازم dehydration.

في ظل درجة الحرارة الجوية تحت الصفر تتكون بين الخلايا كريات من الثلج التي تتكون من ماء البلازما، ونتيجة لذلك يزداد تركيز الأملاح والسكريات الذائبة في البلازما وهذا يؤدي بالتالي الى تخثر البروتين، وبذلك يترسب الثلج بكثافة على سطح الخلايا مما يؤدى إلى إتلافها، وعلاوة على ذلك يمكن أن يتكون الثلج في داخل البروتوبلازم وبذلك تتسبب كريات الثلج الكريستالية في تحطيم تركيب الخلايا وصعوبة إزالتها.

وفى الثلاثينيات تمكن الباحث البيولوجي الأمريكي ب. رايت من الحصول على وسيلة متقدمة لإمكانية تقوية البروتوبلازم وعدم تكوين كريات ثلج كريستالية أي عدم تحطيم تركيب البروتوبلازم وأطلق عليها صلابة البروتوبلازم التي تتكون في ظل التبريد السريع جدا نتيجة لحدوث مظاهر صغيرة بيولوجية مما يؤدى إلى إزالة منطقة الخطورة نتيجة درجة الحرارة التي تتكون وتنمو فيها كريات الثلج الكريستال وتصل عملية تكوينها غالبًا إلى الصفر، وبذلك يتماسك البروتوبلازم كوحدة واحدة.

وعلماء آخرون في الثلاثينيات والأربعينيات أمكنهم تجميد الحيوانات المنوية للديوك والضفادع، وبعد ذوبان الثلج بدأت الحياة والحركة ولكن محاولة الحصول على نسل من الدجاج بالتلقيح بالسائل المنوي المتجمد ثم السائل المنوي الدافئ لم تعط نتائج ناجحة وبالنسبة للسائل المنوي للماشية فإن محاولات تجميده كانت أقل نجاحًا ونفق معظمها.

ولكن النجاحات الأولى الجادة لتجميد السائل المنوي للماشية أمكن الحصول عليها بنجاح فقط في نهاية الأربعينيات. ففي سنة 1948 كان E.V. Smirnov أول من أمكنه تجميد السائل المنوي للأرانب والخيل والكباش والطلايق وكذلك الحصول على نسل من الأرانب التي لقحت بسائل منوي متجمد سبق حفظه خلال تواريخ مختلفة (إلى 32 يوما) في حامض كربونيك جاف في درجة حرارة - 79 م وأكسجين سائل في درجة حرارة - 183 م. وفى سنة 1950 - 1951 نجح سميرنوف Smirnov في الحصول على أول حولي وعجل من أم لقحت بسائل منوي متجمد، ولكن مع التبريد العميق نفق جزء كبير من الحيوانات المنوية.

وبعد ذلك أمكن تحسين طريقة تجميد السائل المنوي في سنة 1951-1953 وتولى ذلك بصفة أساسية العلماء الإنجليز بولدج وروبسون وباركس وآخرون الذين استخدموا مخفف للسائل المنوي في الخطوات التمهيدية قبل تجميده وذلك باستخدام جلسرين، وأمكن إثبات أن الجلسرين نفذ إلى بروتوبلازم الحيوانات المنوية مما أدى إلى أن أصبح الحيوان المنوي يستطيع تحمل التبريد العميق بدون حدوث تحطيم لتركيب وقدرة الحيوانات المنوية على الحياة، ولم يستطيعوا إثبات تكوين أو عدم تكوين كريات الثلج الكريستالية، وقد وضعوا فرضًا أن حجم الثلج الكريستالي كان قليلا لدرجة أنه لم يحطم تركيب البلازما، وحيث أن الجلسرين لا يعتبر ضارًا على الحيوانات المنوية بصورة كاملة لذلك أدى تشبع الحيوانات المنوية بالجلسرين في ظل درجة الحرارة صفر إلى التقليل بصورة كبيرة من تأثيره السام، ولكن لم يتمكنوا من إثبات تأثير الجلسرين على صفات النسل حيث اتضح أن الفحول التي ولدت نتيجة التلقيح بالسائل المنوي المتجمد كانت ذات مظهر عادى وصفات فسيولوجية وراثية عادية. وفى الوقت الحالي أثبتت تجارب مؤكدة إمكانية حفظ السائل المنوي في وسط متجمد خلال سبع سنوات ولا تنخفض صفة خصوبة السائل المنوي بعد هذا التاريخ وأساس تطبيق ذلك أنه في درجة حرارة (-183) - (-196 م) توجد إمكانية حفظ السائل المنوي خلال عشرات السنين، وبناء على ذلك بدأ التفكير في إمكانية حفظ الفائض من السائل المنوي الذي نحصل عليه من طلايق ذات صفات ممتازة، وأن هذا الفائض يمكن أن يُستخدم خلال سنين عديدة بعد نفوق الطلوقة مما يؤدى إلى التقدم في إمكانية إجراء برامج التربية لتحسين الجيوانات.

ويعتبر حامض الكربونيك الجاف (ثلج جاف) والأكسجين السائل ضروريان لأجل حفظ السائل المنوي في صورة متجمدة، ويصبح وسيلة للتقدم في مجال التربية والإنتاج الزراعي والصناعي بكميات كبيرة مما يؤدى نسبيًا إلى عدم ارتفاع أسعار المنتجات.

طريقة تخزين السائل المنوي للطلوقة في الثلج الجاف (حامض الكربونيك الجاف) :

يخفف السائل المنوي بنسبة 1 : 3 بالمخفف glucose - citrate of yolk، وتوضع الزجاجات وبها السائل المنوي المخفف خلال 3 - 4 ساعات في درجة حرارة الصفر (في الثلج) وبذلك يتجمد السائل المنوي إلى درجة الصفر وبه المخفف الجلسرين وتركيبه كالآتي:

ماء مقطر                                 100 مللی لتر

جلوكوز طبي (بدون ماء)            3 جم

سترات صوديوم                        1.4 جم

جلسرين                                  16 مللي لتر

وبعد وضع الجلسرين الذي سبق تبريده في أمبولات زجاجية بحجم 1.5 مللي لتر ويضاف إليه 1.5 مللي لتر من السائل المنوي ولا نلجأ إلى خلطهما معا، ويختلط السائل المنوي بالتدريج بالجلسرين عن طريق الانتشار ثم تدفئة الامبولات بمصباح ضوئي ليحدث الالتحام بين مكونات الخليط بدون حرق السائل المنوي. وتوضع الامبولات في ترموس به ثلج لتصل درجة حرارة الخليط إلى الصفر، وفى خلال مدة 15 - 20 ساعة تنقل الامبولات في ترموس ومغموس في كحول rectiticator alcohol ويبرد إلى درجة صفر م ، وتضاف قطع من الثلج الجاف مع متابعة انخفاض درجة الحرارة بواسطة الترمومتر، ومن درجة الصفر حتى - 15 م مع ملاحظة الانخفاض بسرعة 0.5 م في الدقيقة، ومن - 15 م إلى - 50 م يكون الانخفاض بسرعة 2 م في الدقيقة ثم يحدث التجميد سريعاً حتى - 78 م، ثم تنقل الامبولات في الترمس في الثلج الجاف مع ملاحظة إضافة الثلج في حالة ذوبانه حيث أن ارتفاع درجة الحرارة للسائل المنوي يؤدى إلى فقدان الحيوانات المنوية خلال وقت قصير، وقبل استخدام السائل المنوي نسمح بذوبان التجمد قبل الاستخدام إلى درجة حرارة الغرفة (18 - 20 م)، والسائل المنوي الذائب لابد أن تكون حيويته لا تقل عن 0.3 - 0.4، ومع تكرار التجميد تموت الحيوانات المنوية للسائل المنوي الذائب ولذلك لا ننصح بإجراء التجميد مرة أخرى بعد الذوبان.