معرفة التسلسل النووي DNA Sequencing  

لا شك ان العلماء يحتاجون الى معرفة التركيبة التسلسلية لكل جين وهذا يمكنهم من معرفة المزيد عن البروتين الذي يصنعه ذلك الجين وعن التركيبية التنظيمية لعمل الجين وقد يصلون على ضوء ذلك الى معرفة الامور التي تتحكم في عمله (شكل 1) . كما انه بمعرفة التسلسل النووي للجين يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها ، وقد يعطي هذا معلومات غزيرة عن وظيفية هذا الجين ويختصر الكثير من الابحاث ويتجنب اعادة اجرائها . ومن الطرق الاكثر شيوعا لمعرفة التسلسل النووي لأي قطعة من الدنا هي الطريقة الانزيمية Enzymatic method ويطلق عليها أيضا طريقة سانجر Sanger procedure نسبة الى سانجر الذي اسس هذه الطريقة . كما انها ايضا تعرف بالتسلسل عن طريق دي ديوكسي Dideoxy sequencing .

وترتكز هذا الطريقة على مفهوم ان شريط الدنا في الاساس تكون من جزيئات من الديوكسي نيوكليوتيد . ويختلف الديوكسي نيوكليوتيد عن دي ديوكسي نيوكليوتيد بعدم وجود مجموعة الهيدروكسيل في النقطة الثالثة من حلقة السكر الخماسية الشكل .

شكل (1) : الطريقة الانزيمية لمعرفة التسلسل النووي

ويوجد على النقطة الثالثة من حلقة السكر الرايبوزي مجموعة هيدروكسيل (OH) وهذه النقطة هي التي ترتبط في النقطة الخامسة من الجزيء الذي يليها وهكذا يتم الترابط لتكون شريط طويل من الدنا . ولقد قام سانجر بالاستفادة من هذه الخاصية فبدل الجزيء من OH الى H  عن طريق اضافة دي ديوكسي نيوكليوتيد (ddNTPs) بدل من الديوكسي نيوكليوتيد (dNTPs) وذلك عن طريق نسخ شريط مرة اخرى ويؤدي هذا الى توقف ترابط الجزيئات ويكون في طرف كل جزئ نوع واحد من الاحماض النووية .

وفيما يلي الخطوات الاساسية للقيام بهذا الاختبار بالترتيب :

1- القيام بنسخ الدنا وذلك على الشكل التالي :

ا- يضاف الى عينة الدنا قطع من بريمر متخصص والذي سوف يلصق الدنا المراد نسخة ومعرف (ملتصق بطرفه) بعنصر مشع .

ب- تقسم العينة الى اربع انابيب اختبار وكل انبوبة يكتب عليها الاسماء التالية dGTP ,dATP ,dCTP , and  dTTP  .

ت- يضاف انزيم DNA polymerase  

ث- يضاف الى كل انبوبة نوع واحد من الدي ديوكسي نيوكليوتيد حسب اسم الانبوب . ويضاف معه كمية من ديوكسي نيوكليوتيدة ، وبذا سوف يحدث التفاعل ويبدا البريمر ببناء وتركيب ورص هذه الاحماض الامينية . وعند اضافة الدي ديوكسي نيوكليوتيد فان الشريط يتوقف عند هذه النقطة ، ثم يحدث تفاعل اخر لنسخ شريط اخر ، وعند اضافة دي ديوكسي نيوكليوتيد يتوقف التفاعل وهكذا تستمر العملية وينتج في النهاية قطع منسوخة ومتفاوتة الطول في كل انبوب اختبار .

2- يضاف كمية من كلا الانابيب الاربعة في فتحات خاصة Wells على لوح جل الاكاروز ثم يمرر تيار كهربائي ومن ثم يظهر على طول اللوح القطع    المنسوخة والمتفاوتة الطول وكل فتحة تعطي ترتيب القطع .

3- يعرض الجل الى الاشعة  Autoradiography لكي يتسنى رؤية الدنا ولكن بصورة مشعة

4- يتم القراءة على لوح جل الاجاروز من اسفل الى اعلى ، وكلما تمر الاشعة على نسخة من الدنا يتم التعرف عليها وكلك ترتبيها ونوع الديديوكسي نيوكليوتيد الموجودة في طرفها الى ان ينتهي لوح الاجاروز .

ولتسهيل عملية القراءة يستخدم الكمبيوتر في القراءة بشكل الي وذلك بتعريض لوح جل الاجاروز لأشعة ليزر وعن طريق وحدة استشعار ومكبر للنبضات photomultiplier يستطيع الكمبيوتر ان يحدد نوع الدي ديوكسي نيوكليوتيد وترتيبها وطبعها ورسمها بيانيا . وبذا يتلون كل حامض نووي بلون مختلف . ولا تستخدم المواد المشعة في القراءة الالية بالكمبيوتر بل يستعاض عنها بمادة مضيئة فلورسنت توضع على البريمر على ان يكون لكل دي ديوكسي نيوكليوتيد لون مختلف عن الاخر وبذلك يمكن ان تمر جميع القطع في ممر واحد (شكل 2) . ونظرا الى ان جهاز الكمبيوتر قابل للخطأ فانه يلزم التدقيق والمراجعة لتفادي حدوث الاخطاء . ولقد جهزت اجهزت كمبيوتر عملاقة تعمل على مدار الساعة وتحت مظلة مشروع الجينوم البشري بالكشف والتعرف الكامل (99% تقريبا ) من التسلسل النووي لجميع الدنا الموجود في الانسان وقد سبق ذلك الكشف عن التسلسل النووي لكثير من الكائنات الحية والعمل جاري لمعرفة المزيد .

شكل (2) : استخدام الكمبيوتر في القراءة بشكل الي

المصادر:

عبيده ، علي ابراهيم علي و محمود ، احمد عبد الفتاح .اساسيات التقنية الحيوية . كلية الزراعة جامعة الاسكندرية .