التدرن الدقيق المخبري Microtuberisation (انتاج المحاصيل الدرنية بتقنية التكاثر الدقيق)

مقدمة:

تستخدم تقانة التدرن الدقيق بالنسج في انتاج بذار المحاصيل الدرنية مثل البطاطا العادية والبطاطا الحلوة تعد البطاطا من أحد أهم المحاصيل الزراعية في العالم وأحد الأغذية الأساسية في البلدان النامية، ويرجع ذلك لوفرة غلتها، وتنوع الظروف البيئية التي تنمو فيها، كما تستخدم علفاً للحيوانات وفي الصناعة إذ يستخرج منها النشاء والكحول وبعض الأحماض العضوية مثل الستريك واللاكتيك. وتستعمل في صناعة الورق والمنسوجات.

يتوقف مردود البطاطا في وحدة المساحة على عوامل كثيرة معروفة، منها العمليات الزراعية المختلفة، والظروف البيئية ومدى ملاءمة التربة والصفات الوراثية للصنف المزروع ومن أهم العوامل المؤثرة في الإنتاجية جودة البذار وخلوه من الإصابات المرضية وخاصة البكتيرية والفيروسية.

إنتاج بذار البطاطا بالنسج:

تعد تقانات زراعة الأنسجة النباتية الطريقة المثلى والمتبعة في معظم أنحاء العالم لإكثار بذار أصناف البطاطا الخالية من الأمراض الفيروسية وذلك عن طريق استخدام الزراعة المرستيمية كنقطة انطلاق (1994 Manthel et al., 1978; Ermishin).

ولما كانت البطاطا تتكاثر خضريا بالدرنات وهذه الطريقة تتيح الفرصة لانتقال الإصابات المرضية من الآباء إلى الأجيال اللاحقة وخاصة تلك التي لا يمكن مقاومتها مثل الأمراض الفيروسية عبر الأجيال وتؤدي إلى نقص حاد بالمحصول الدرني، والتدهور الفيزيولوجي لبذار البطاطا نتيجة زراعته عدة مواسم متتالية.

لذلك لابد من وضع برنامج لإكثار بذار البطاطا يبدأ من الزراعة المخبرية، ويمر بالزراعة في البيوت الزجاجية والبلاستيكية حتى الزراعة الحقلية المكشوفة بهدف إنتاج البذار الخالي من الامراض وخاصة الفيروسية.

يتم إكثار البطاطا بالنسج بطريقتين:

1- إنتاج شتول بأعداد كبيرة بالنسج بعد تقسيتها في البيوت الزجاجية.

2- إنتاج درينات دقيقة Microtubers بالمختبر باستخدام اوسط مغذية

مزايا إكثار البطاطا بزراعة الأنسجة:

يتم الحصول على كميات كبيرة من الشتول أو الدرينات الدقيقة الخالية من الأمراض الفيروسية خلال فترة زمنية محدودة، تمثل هذه المادة النباتية الناتجة نواة لإنتاج بذار على النطاق التجاري (1987,Bajaj).

تتصف النباتات المكاثرة بالنسج بإنتاجية عالية بالمقارنة مع انتاجية النباتات المكاثرة بالدرنات (2003 ,.Donnelly et al).

يسهل تبادل الأصناف بين الدول دون نقل الأمراض، كون العينات النباتية مزروعة في وسط معقم خال من التلوث. إمكانية حفظ الأصناف والمصادر الوراثية من التدهور لفترات زمنية متوسط وطويلة الأمد على درجات حرارة منخفضة جدا بالآزوت السائل ( Altoveros et al., 1995 ).

مزايا إكثار البطاطا بالدرينات الدقيقة:

- لا يحتاج إكثار البطاطا بالدرينات لعملية تقسية مثل إكثار الشتول داخل الأنابيب وبالتالي تكون تكلفة الإنتاج أقل ( 2005,Rolot ).

- يمكن تطبيق هذه التقانة في إكثار عدد كبير من أصناف البطاطا، والحصول على درينات دقيقة في فترة زمنية قصيرة، بهدف تشكيل بنك وراثي لحفظها كون الدرينات الدقيقة سهلة التخزين.

- تعد الدرنات الناتجة من زراعة الدرينات الدقيقة في الحقل أكبر حجماً من الدرنات الناتجة من زراعة النباتات النسيجية ( 1987 ,Wiersema et al ).

- يتم اختصار الفترة الزمنية في برنامج إنتاج البذار عند استخدام الدرينات الدقيقة، حيث يعد انتاج الدرينات الدقيقة في الأنابيب مؤشر على قدرة تدرن أصناف البطاطا في الحقل.

يسهل تخزين الدرينات الدقيقة للأصناف المختلفة في حيز ضيق من المساحة، كما يسهل نقل المصادر النباتية بين الدول.

طريقة الإكثار بالتدرن الدقيق المخبري:

تشمل عملية إكثار البطاطا عن طريق تكوين الدرينات الدقيقة بالنسج المراحل الآتية:

1- مرحلة الزراعة الأولية: يتم بها عزل قمم مرستيمية وزرعها في أوساط مغذية سائلة أو صلبة بهدف الحصول على عينات نباتية خالية من التلوث، ولها قدرة على النمو والاستطالة. يتم عادة زرع قمم مرستيمية صغيرة جدا بين 0.1-0.3مم بهدف الحصول على نموات خالية من الأمراض الفيروسية.

2- مرحلة الإكثار والاستطالة: في نهاية طور الزراعة الأولية للقمم المرستيمية يتم الحصول على نموات صغيرة بطول 1-2 سم، ويتم نقلها إلى طور الإكثار والنمو بهدف زيادة عدد النموات الخضرية الممكن الحصول عليها. يتصف نموذج الإكثار بالبطاطا بالنمو العمودي، أي يتم السعي في هذا الطور نحو توجيه العينات النباتية إلى إعطاء نموات طويلة، جيدة التكوين وغير رفيعة يصل طول النموات في نهاية دورة الإكثار التي تستمر بين 3-4 أسابيع، بين 12-15سم وتحوي 6-10 عقل جانبية جيدة التكوين.

وتكرر عملية الإكثار بتقسيم النبات إلى عقل صغيرة بطول 1-2 سم وتحوي برعم جانبي مع ورقة. وهذه العقل تعطي بدورها في نهاية دورة الإكثار نموات طولية جديدة وهكذا حتى يتكون لدينا كم من النموات كافية للبدء بالنقل إلى وسط تكوين الدرينات الدقيقة. يجب التأكد قبل الإكثار التجاري للعينات الناتجة من خلوها من الأمراض الفيروسية بوساطة عدة اختبارات مثل النباتات الدالة، الطريقة المناعية الـ ELIZA، والـ RT-PCR.

3- مرحلة تكوين الدرينات الدقيقة بالنسج يتم نقل النموات والعقل المتكونة إلى وسط خاص بحيث تتوافر به كافة الشروط المناسبة لتكوين الدرينات، إذ يضاف عادة السكروز بتركيز مرتفع مع السيتوكينين وبعض مثبطات النمو مثل الـ CCC أو الباكلوبوترازول. وتوضع العينات النباتية بفترة بالظلام لتحريض تكوين الدرينات ولابد من دراسة تفصيلية لبعض العوامل المؤثرة بالتدرن الدقيق المخبري.

4- مرحلة حصاد الدرينات الدقيقة: تجمع الدرينات الدقيقة المتكونة داخل الأنابيب، وتغسل بالماء الجاري لإزالة بقايا الوسط المغذي، ويفضل معاملتها بمبيد فطري قبل تخزينها في البراد على درجة حرارة 2-3م لمدة 3-4 أشهر لكسر طور سكونها وتصبح لها المقدرة على الإنبات، ليتم متابعة برنامج انتاج البذار الخالي من الفيروسات حيث يتم الحصول بزراعة النسج على درينات أو نباتات تمثل FO ويمكن إكثارها بالبيت الزجاجي للحصول على درينات صغيرة Minitubers التي تمثل F1. وبعدها يتم متابعة إكثار النباتات أو الدرنات بالحقل ضمن برنامج لإنتاج البذار بمراحله المختلفة، حتى الوصول إلى مرحلة تسويق البذار.

العوامل المؤثرة في تكوين الدرينات داخل الأنابيب:

تعد عملية تكون الدرينات عملية فيزيولوجية معقدة، إذ تتأثر بجملة عوامل:

1- عوامل غذائية: نسبة السكروز بالوسط، تركيب المحلول المعدني - نسبة C/N.

2- عوامل هرمونية: بعض الهرمونات المحرضة للتدرن مثل السيتوكينين وحمض الأبسيسيك والبعض الآخر مثبط للتدرن مثل الأوكسين والجبريلين.

3- عوامل مناخية درجة الحرارة المثلى بين 16-19م ودرجة الحرارة العالية مثبطة. الإضاءة ظروف النهار القصير والظلام محرضة للتدرن.

4- عوامل وراثية: تختلف استجابة الأصناف للتدرن وذلك باختلاف تركيبها الوراثي.

1- تأثير السكروز في تكوين الدرينات الدقيقة:

تؤثر نسبة السكر في الوسط المغذي في تكوين الدرينات الدقيقة داخل الأنابيب، ويتطلب تكوين الدرينات نسبة عالية من السكروز في الوسط حيث تؤثر بشكل مباشر في رفع نسبة C/N مما يحفز في تكوين الدرينات الصغيرة.

ففي تجربة نفذت على تكوين الدرينات الدقيقة في صنفين من البطاطا الدراجا والبورو. أخذت نتائج التدرن بعد 60 يوما من زراعة العقل المفردة على وسط التدرن المضاف له تراكيز مختلفة من السكروز (0-20-40-60-80 و 100 غ/ل)، تحت ظروف النهار القصير، جمعت العينات وحسبت النسبة المئوية للتدرن ومتوسط وزن الدرينات المتكونة، كما هو موضح بالجدول التالي:

جدول يبين تأثير السكروز في التدرن الدقيق المخبري في البطاطا

بلغت أعلى نسبة تدرن للأصناف المذكورة عند التركيز 80 غ/ل، كما لوحظ أعلى متوسط وزن للدرينات المتكونة (2008 ,.ALMarri et al). وقد لوحظ فرق واضح بقدرة الأصناف في تكوين الدرينات بالأنسجة ويعزى ذلك للاختلاف في التركيب الوراثي لهذه الأصناف.

وقد دلت بعض التجارب المنفذة في الصين أن العامل الأساسي في تكوين الدرينات الدقيقة داخل الأنابيب هو محتوى الوسط المغذي من السكروز، وقد تم الحصول على تشكل الدرينات في عدة أصناف من البطاطا مثل صنف ديزيريه Desiree عند إضافة 80 غ/ ل من السكروز، تحت ظروف إضاءة مختلفة (نهار طويل - نهار قصير - وإضاءة كاملة). ولم يلاحظ أي فروق معنوية في نسبة التدرن وفي متوسط وزن الدرينات المتكونة ( He and Meng, 2016 ).

وقد لوحظ ارتفاع نسبة السكروز في الدرينات وانخفاض نسبة النشاء داخل الأنسجة، كما لوحظ زيادة نسبة نشاط الأنزيم سكروز سينيتاز Sucroses synthetase وانزيم سكروز - فوسفات - سينتيتاز Sucrose – Phosphate - Synthetase في الأنسجة النباتية في ظروف التجربة (2016 ,He and Meng) .

2 - تأثير الهرمونات النباتية في التدرن الدقيق:

تلعب الهرمونات النباتية دوراً مهماً في التدرن الدقيق المخبري. يختلف التأثير الهرموني بحسب الأصناف وحسب نوع الهرمون المستخدم وحسب التوازن بين الهرمونات في الأوساط المغذية. تعمل بعض الهرمونات في تحفيز تكوين الدرينات بالنسج مثل السيتوكينين (2001 ,.Wang &Hu,1982 ; ALTaweel et al )، كما هو موضح بالجدول التالي.

جدول يبين تأثير الهرمونات النباتية في تكوين الدرينات الدقيقة.

أما بعض الهرمونات مثل الجبريلين تعمل على تثبيط تكوين الدرينات بالنسج. وقد دلت التجارب على اهمية استعمال بعض مثبطات النمو في تشجيع التدرن الدقيق مثل حمض الأبسيسيك والكومارين ( 1988,.Dodds et al )، وحمض الجاسمينويدس Jasminoids Acid (Pelacho et al., 1993).

وقد وجد بالتجربة أن نسبة حمض الأبسيسيك / حمض الجبريليك تؤثر بشكل واضح في تكوين وتنظيم نمو وكسر طور سكون الدرينات الدقيقة وقد وجد بالتجربة بان إضافة الـ ABA إلى وسط التدرن شجع التدرن بعكس إضافة الجبريلين.

ولابد من الذكر أنه في بعض التجارب لم يعط إضافة الأبسيسيك أسيد أي نتيجة إيجابية لا بل على العكس أدى إلى تخفيض تكوين الدرينات بالنسج ( 2004,.gophal et al ). ولكن لوحظ بان إضافة بعض المركبات مثل باكلوبوترازول Paclobutrazol ، والـ ( Chlorocholine Chloride ) CCC مع السيتوكينين ( الكينتين أو البنزيل أمينو بيورين) زاد بشكل كبير من تكوين الدرينات الدقيقة ومن وزنها ( Yamamoto and Nakata, 1997; Zang et al., 2004; Sakha et al., 2004 ).

مثال على تأثير الهرمونات النباتية في التدرن الدقيق بالبطاطا:

تمت دراسة تأثير كل من السيتوكينين BAP لوحده، والـ CCC لوحده بتركيز 200 و 500 مغ/ل. وتم إضافة الـBAP مع الـ CCC معا وقد استخدمت في هذه التجربة نموات من البطاطا من صنف بينيمارو Benimaru، بطول 5-6سم تحوي 3-4 عقل وقد زرعت بشكل أفقي في وسط التدرن الذي أضيف له الهرمونات النباتية آنفة الذكر. وقد سجلت بعد شهر من الزراعة عدد الدرنات المتكونة في كل معاملة ومتوسط وزن الدرينات كما هو موضح بالجدول السابق.

من الجدول يتبين لنا بأن إضافة السيتوكينين لوحده يحسن تكوين الدرينات كما إضافة ال CCC لوحده زاد في نسبة الدرينات الدقيقة المتكونة بالنسج كما زاد في وزن الدرينات المتكونة، اما إضافة السيتوكينين مع ال CCC قد زاد بشكل كبير نسبة الدرينات المتكونة وفي متوسط وزنها.

يعزى هذا الأثر الإيجابي للـCCC مع السيتوكينين بكون هذا المركب يثبط تكوين الجبريلين في أنسجة العينات النباتية وينشط بنفس الوقت اصطناع حمض الجاسمينوسك الذي يدعى هرمون التدرن مما يحفز تشكل الدرينات الدقيقة وزيادة وزنها في الأنابيب (Husain et al., 2006, Yamamoto and Nakata, 1997).

وفي تجربة اخرى تم استبدال الCCC بمركب الباكلوبوترازول 1مغ/ل وقد أدى على نتائج مماثلة في تنشيط التدرن الدقيق وفي زيادة وزن الدرينات المتكونة وانخفضت نسبة الدرينات المشوهة (2004,Zang et al). هذا يعني يمكن الاستعاضة بهذا المركب بدل الـ CCC.

2- تأثير الإضاءة في التدرن الدقيق المخبري:

تلعب الإضاءة وخاصة الفترة الضوئية دوراً مهماً في التدرن الدقيق المخبري. تختلف استجابة أصناف البطاطا المختلفة للضوء. بشكل عام فقد وجد إن تعريض العينات النباتية أثناء طور التدرن لفترة ظلام تزيد بشكل كبير من نسبة التدرن ومتوسط وزن الدرينات المتكونة. يمكن تفسير دور الظلام بكونه يثبط اصطناع الجبريلين الذي يتكون بشروط الإضاءة الطويلة (16 ساعة إضاءة و 8 ساعات ظلام)، كما ينشط تكوين حمض الجاسمينوئيك Jasminoic Acid هرمون التدرن بفعل الظلام.

كما تؤثر شروط النهار القصير في تنشيط تكوين الدرينات بالنسج ويكون تأثيره قريب من تأثير الظلام. أما في حال النهار الطويل فتكون نسبة التدرن منخفضة، حجم ووزن الدرينات المتكونة صغير (2008,Jackson ,1999; ALMaarri et al).

ولابد من القول أخيراً بأن يوجد في برنامج إنتاج بذار البطاطا قسمان: قسم مهم جداً للحصول على نباتات ودرينات الدقيقة للجيل صفر F0، وهذا يتم بوساطة تقانات زراعة الأنسجة النباتية ضمن مخابر متخصصة ومجهزة لهذا الغرض. والقسم الثاني يتم به إكثار النباتات للحصول على درنات الأجيال اللاحقة حتى الوصول إلى جيل الأليت ويتم العمل في البيوت الزجاجية والبيوت البلاستيكية الشبكية وفي الحقل للوصول إلى البذار المناسب الذي يباع للمزارعين على انه بذار موثوق خالي من الفيروسات.

برنامج إنتاج بذار البطاطا بزراعة النسج

تؤثر الإصابة بالأمراض الفيروسية بشكل مباشر على إنتاجية ونوعية البطاطا المنتجة في الحقول. تعمل الفيروسات في بذار البطاطا إلى خفض إنتاجية المحصول من الناحية الكمية، وإلى إنتاج محصول ذو نوعية سيئة تختلف نسبة الخسارة في المحصول حسب نوع الفيروس وحسب الأصناف. ولذلك يوجد قوانين صارمة في كثير من الدول التي لا تسمح باستعمال بذار إلا بعد التأكد من خلوه من الأمراض الفيروسية الخطيرة مثل Y and X . يتم إنتاج البذار باستخدام زراعة الميرستيم لإنتاج نباتات مخبرية أو لإنتاج درينات دقيقة خالية من الإصابات الفيروسية.

مراحل إنتاج البذار الخالي من الفيروسات:

يشمل إنتاج بذار خالي من الأمراض الفيروسية المراحل التالية:

1- المرحلة المخبرية: ويتم بها إنتاج نباتات مخبرية بزراعة الميرستيم داخل مخبر زراعة النسج ويجب أن تكون الشتول المخبرية خالية 100% من الأمراض الفيروسية بأنواعها المختلفة. كما يتم إنتاج درينات الدقيقة من عينات ناتجة عن زراعة الميرستيم، ويجب أن أيضا تكون الدرينات خالية من الفيروسات بالـ 100%.

ويتم المحافظة على العينات بطرائق الحفظ بزراعة النسج أو يمكن حفظها بالكبسلة لفترات زمنية طويلة بالآزوت السائل. ويطلق على النباتات الناتجة بـ F0. يتوجب في هذه المرحلة فحص كافة السلالات الخضرية المكاثرة بزراعة النسج باستخدام إحدى تقانات الفحص الفيروسي مثل النباتات الدالة أو ال ELIZA أو باستخدام طرائق البيولوجيا الجزيئية مثل الـ RT-PCR. ويجب استبعاد كافة السلالات المشتبه بإصابتها بالأمراض الفيروسية. ويتم المحافظة على السلالات الخالية من الفيروسات ليصار إلى إكثارها واستخدامها في إنتاج البذار في المراحل التالية. كما يتوجب في هذه المرحلة تعليم الجيد للسلالات والأصناف حتى لا يتم خلط بين الأصناف، ويمكن ذلك بتخصيص كل رف أو مجموعة رفوف لصنف محدد. ويفضل عمل مخطط لأماكن تواجد الأصناف في غرف النمو وفي أماكن تخزين السلالات والأصناف المختلفة.

2- مرحلة البيوت الزجاجية:

تهدف هذه المرحلة إنتاج الأمهات أو النويات داخل بيوت زجاجية جيدة العزل. يفضل في هذه المرحلة أيضا إمكانية فصل السلالات الخضرية الناتجة من المرحلة الأولى. يتوجب أخذ عينات من كافة السلالات للتأكد من خلوها من الأمراض الفيروسية. تستبعد أية سلالة مصابة أو مشتبه بإصابتها بأحد الفيروسات، في جيل الأمهات يجب أيضا تكون نسبة الإصابة بالفيروسات 0%.

تزرع درينات الدقيقة الناتجة من المرحلة الأولى في المخبر، بعد حصادها وكسر طور سكونها بهدف تكوين درينات أكبر حجما وزيادة عددها يتوجب زرع كل صنف على حدى أو في طاولة مستقلة، كما تخضع للاختبارات الفيروسية بحيث يتم استبعاد كل السلالات المصابة من برنامج الإنتاج. يتوجب أن تكون الدرينات الأمهات الناتجة سليمة بالـ 100%.

3- مرحلة البيوت المحمية الشبكية: يقصد بها إنتاج السوبر إيليت، يتم زرع الدرينات والدرنات الناتجة من البيوت الزجاجية بهدف إكثارها وزيادة عددها يتم زرعها في بيوت تنقل الفيروسات. يجب أن تكون البيوت الشبكية في اماكن معزولة، بعيدة عن أماكن زراعة البطاطا ونباتات العائلة الباذنجانية. يجب اختبار النباتات للتأكد من خلوها من الأمراض الفيروسية مرة كل 15 يوم، لا يسمح أن تكون الإصابة بالفيروسات في السوبر إيليت بين 0.5-1%. يمكن تكرار إكثار السوبر إيليت عدة مرات بشرط أن لا تزيد نسبة الإصابة بالأمراض الفيروسية أكثر من 1 (SE 1-SE2-SE3...).

4- مرحلة الحقول المكشوفة لإنتاج الإيليت: يتم زرع السوبر إيليت في حقول مفتوحة ومعزولة بهدف الإكثار وزيادة كمية البذار الناتجة. يجب أن تكون الحقول المختارة بعيدة عن أماكن زرع البطاطا ونباتات العائلة الباذنجانية لأنها تمثل نفس عوائل الفيروسات التي تصيب بذار البطاطا. يجب القيام بالكشف الدوري عن الأمراض الفيروسية مرة كل 15 يوم، ويجب ألا تزيد نسبة الإصابة في مرحلة الإيليت عن 1-2 %. ويمكن إكثار هذه المرحلة عدة مرات على شرط ألا تزيد نسبة الإصابة عن 2 % ( E1-E2E3.... ). يتوقف سلسلة إكثار الإيليت عندما تصل نسبة الإصابة الفيروسية إلى 5%، ففي هذه الحالة توزع كبذار على المزارعين لإنتاج بطاطا الطعام. ويوضح الشكل التالي مراحل إنتاج بذار البطاطا بزراعة النسج.

شكل يبين مراحل إنتاج البذار في البطاطا

ولابد من التذكير أخيراً بأن هذا البرنامج لإنتاج بذار البطاطا معتمد بشكل كبير في كثير من الدول المشهورة بزراعة البطاطا، وتوجد شركات كثيرة في العالم التي تعمل في إنتاج بذار البطاطا. ويتم إنتاج مئات الآلاف من الأطنان من بذار البطاطا سنوياً باستخدام تقانة زراعة النسج للميرستيم وإنتاج ميكروتيوبر بزراعة النسج خالية من الأمراض الفيروسية. ويعد مشروع إنتاج بذار البطاطا من المشاريع الواعدة والرابحة والقابلة للاستثمار. ويوجد في القطر الخبراء والفنيين الذين يستطيعون وضع هذه التقانة لإنتاج البذار الخالي من الأمراض الفيروسية قيد التنفيذ والإنتاج بخبرات وطنية لسد حاجة القطر من البذار والاستغناء عن الاستيراد بالعملة الصعبة.