مراحل الإكثار بواسطة زراعة الأنسجة

Stages of micro-propagation via tissue culture technique

يهمنا هنا وقبل أن نسترسل في عرض ما هو متقدم في تكنولوجيا زراعة الأنسجة النباتية أن نستعرض معا في اطار مبسط المراحل التي يمر بها النسيج المنزرع علي بيئة مغذية بداية من فصل هذا النسيج من النبات الأم وزراعته على البيئة المغذية حتي الحصول علي نباتات كاملة لها القدرة على النمو في الحقل تحت الظروف البيئية الطبيعية. تقسم الفترة التي يقضيها النسيج المنزرع على البيئة المغذية الي مراحل مختلفة .. وهذا ليس بالأمر الجديد حيث أنه قد سبق وصف هذه المراحل بواسطة العالم (1974) Murashige الذي أوضح أن هناك ثلاث مراحل يمر بها النسيج المنزرع وهي:

- مرحلة انشاء المزرعة النسيجية.

- مرحلة التضاعف على البيئة المغذية.

- مرحلة تكوين الجذور.

بالرغم من أن هذه المراحل الثلاث تغطي المراحل التطورية التي يمر بها النسيج المنزرع في البيئة المغذية، غير أنه تم حديثا اضافة مرحلتين هامتين أحدهما تعني بأعداد النبات الأم الذي يؤخذ منه النسيج الزراعية على البيئة المغذية والمرحلة الاخرى تعنى بتهيئة النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة لتتواءم مع الظروف الطبيعية المحيطة أي الزراعة في الحقل، وبهذا تصبح المراحل التطورية التي تميز التكاثر بواسطة زراعة الأنسجة النباتية هي:

- مرحلة اعداء النباتات الأم.

- مرحلة انشاء المزارع النسيجية.

- مرحلة التضاعف علي البيئة المغذية.

- مرحلة تكوين الجذور.

- مرحلة الاقلمة.

1- متطلبات مراحل الاكثار propagation stages - Requirement of micro

مما لاشك فيه أن كل مرحلة من هذه المراحل لها متطلبات يجب أن تراعي للحصول علي استجابة عالية للنسيج المنزرع، ولهذا فأننا سوف نتناول كل مرحلة بالتفصيل ليتسنى للقارئ الاطلاع على أهمية هذه المراحل والنقاط التي يجب أن تراعي عند كل مرحلة.

1.1 مرحلة اعداد النباتات الام Preparation of mother plants

من الأمور الهامة عند بداية العمل التأكد من النوع والصنف النباتي المراد اكثاره عدم التأكد من النوع النباتي يؤدي الى ضياع الوقت والمجهود وقد يؤدي الي الفشل في عملية الاكثار ذاتها.

أثبتت التجارب العديدة في مجال زراعة الأنسجة النباتية أن استجابة النسيج المنزرع تتوقف على مدي قوة النبات الأم والموسم الذي يؤخذ فيه النسيج للإكثار بواسطة زراعة الأنسجة، ولهذا فانه يجب أن يراعى أن يكون النبات الام خاليا من ايام من اجراء الزراعة، وفي حالة وجود اصابة داخلية بالنسيج المنزرع فان التلوث يظهر بعد حوالي 10 أيام من الزراعة.. كما أن وجود التلوث في البيئة المغذية في مكان بعيدا عن النسيج المنزرع وخلال الأيام الأولي من الزراعة يدل على عدم مراعاة الدقة أثناء عملية زراعة النسيج النباتي. ولهذا فانه في حالة وجود تلوث في مزارع الأنسجة يجب أن تدرس جيدا ويحدد مصدرها حتي يسهل تجنب مصادرها المختلفة. هناك بعض الصعوبات التي تواجه الباحثين في مجال زراعة الأنسجة حيث أنه في بعض الأنواع النباتية يتحول النسيج المنزرع بعد بضعة أيام الى اللون البني ويتلو هذا غالبا موت النسيج وفشل اكثار النبات، غالبا يعزو هذا الى انطلاق الفينولات من النسيج المنزرع وهذا بدوره يرجع الي الضرر الميكانيكي الذي يحدث للنسيج أثناء فصله من النبات الأم .. ويمكن التغلب على هذه المشكلة بواسطة التخلص من الفينولات التي تفرز في البيئة المغذية او تقليل نشاط الأنزيم المسئول على تمثيل الفينولات، كما يمكن التخلص من تأثير المواد الفينولية بواسطة استمرار نقل النسيج المنزرع الي بيئة حديثة التحضير، ويعتمد طول الفترة التي يجري عليها النقل على النوع النباتي المنزرع وكمية المواد الفينولية المتكونة وغالبا يجري النقل على فترات زمنية متقطعة تتراوح بين 1-5 أيام. تعتبر البيئة المغذية السائلة أفضل أنواع البينات التي تستخدم مع الأنسجة التي تنتج فينولات. هذا لأن الفينولات تتوزع في البيئة المغذية وبذلك يتم تخفيف تركيزها وكذا تأثيرها. كما أنه يسهل احلال البينة المغذية السائلة التي تحتوي فینولات بيئة مغذية مجهزه حديثا، ومن الطرق الأخرى التي بواسطتها يتخلص من الفينولات اضافة الفحم النباتي النشط أو مادة (PVP) إلى البيئة المغذية.. عندما ترتبط الفينولات بهذه المواد تفقد تأثيرها المثبط على نمو النسيج النباتي المنزرع.

3.1 مرحلة تضاعف النسيج المنزرع Multiplication of the cultured tissue

الهدف الأساسي في هذه المرحلة هو الحصول على تضاعف سريع للجزء النباتي المنزرع على بيئة مغذية.. هناك طرق عديده لإنجاز هذه المرحلة تشمل انتاج اجنة جسدية، تنشيط نمو البراعم العرضية، تنشيط نمو الأفرع الجانبية.

۱ . ۳ . ۱ الأجنة الجسدية Somatic embryos

انتاج الأجنة الجسدية هي طريقة ذات كفاءة عالية لإكثار المادة النباتية وعبارة عن تحول خلية نباتية الي جنين غالبا له نفس التركيب الوراثي للخلية الأم التي نشأ منها. يمكن الحصول على الأجنة الجسدية اما من خلال زراعة معلق الخلايا أو من الكالس المنزرع على بينة مغذية (1983) Ammirato.

۱ .۳ .۲ تنشيط نمو البراعم العرضية Stimulation of auxilary buds

عند زراعة جزء نباتي يحتوي على برعم عرضي فان هذا الأخير بنمو الي فرع خضري أو عديد من الأفرع الخضرية، وهذه بدورها تحتوي علي براعم عرضية التي تنمو بدورها الي أفرع خضرية وبتكرار هذه الدورة فانه يحدث تضاعف للمادة النباتية المنزرعة. من الجدير بالذكر أن هذه الدورة يمكن أن تكرر الي مالا نهاية ما لم يتم نقل النسيج النباتي الى بيئة معدلة التركيب بهدف انتاج جذور على الأفرع الناتجة. بالرغم من أن هذه الطريقة تعتبر ابطا الطرق المستخدمة في اكثار المادة النباتية، غير أنها شائعة الاستخدام في بعض الأنواع النباتية التي يصعب فيها الحصول على أجنة جسدية من النسيج المنزرع.

۱. ۳.۳. تنشيط نمو الأفرع الجانبية Stimulation of lateral buds

تنشأ البراعم الجانبية في مزارع الأنسجة النباتية من مناطق مختلفة من النسيج المنزرع وليست من البراعم الطرفية أو البراعم العرضية فهي تتطور من الجذور، السوق الأوراق، الكورمات، الريزومات، الكالس. يعتبر الكالس مادة وسطية بين النسيج المنزرع والأفرع الجانبية، حيث ينتج الكالس أولا من النسيج المنزرع والمنفصل من النبات الأم ويتلو هذا تكون أفرع جانبية من الكالس المتكون.. غير أن استخدام هذه الطريقة لمضاعفة المادة النباتية المنزرعة غير مفضلة لأنها قد تؤدي الي حدوث تغيرات في المادة الوراثية نظرا لطول الفترة التي يقضيها النسيج علي بيئة مغذية فقد يؤدي هذا الي التضاعف الكروموسومي، هذا بالإضافة الي التغيير الذي قد يحدث للتركيب الجيني.

1. 4 مرحلة تكوين الجذور في البيئة المغذية Root formation in nutrient medium

الهدف الأساسي من هذه المرحلة هو تكوين جذور على الأفرع المتكونة في المرحلة السابقة، ويتم هذا بواسطة نقل الأفرع النباتية المتكونة الى بيئة مغذية ذات تركيب مناسب لتنشيط انتاج الجذور وغالبا ما تكون البيئة المغذية متماثلة في الأملاح الأساسية وتختلف فقط في تركيب وتركيز منظمات النمو، تختلف العناصر اللازمة لتنشيط تكون الجذور تبعا للنوع النباتي المستخدم، حيث أن بعض الأنواع تحتاج الي النقل من بيئة تحتري سیتوكينين الى بيئة خالية من السيتوكينين، بعض الأنواع الأخرى تحتاج الي النقل الي بيئة مغذية تحتوي اکسين وخالد من السيتوكينين .. هنا يجب الاشارة الى أن تكوين الجذور في بعض الانواع النباتية قد يحتاج الى اضافة اكسين، غير أن تطور هذه الجذور قد يثبط بوجود الاكسين في البيئة المغذية، بناءا على هذا فانه يجب النقل الي بيئة خالية من الاكسين وذلك لتنشيط تطور الجذور. كما أن بعض الأنواع النباتية تحتاج الى الزراعة على بيئة مغذية تحتوي نصف التركيز الملحي للعناصر الكبرى والصغرى وقد يرجع هذا الى أن النبات المتكون لا يحتاج تركيز مرتفع من النيتروجين في البيئة المغذية .. كما أن التركيز العالي من العناصر الأخرى ليس له تأثير ملحوظ علي النمو أو تكوين الجذور. مما لاشك فيه أن الظروف البيئية مثال التهوية، الضوء، الحرارة ... وغيرها تلعب دورا هاما وأساسيا في عملية تكوين الجذور، ولقد لوحظ أن الشعيرات الجذرية لا تتكون على الأفرع المنزرعة في بيئة مغذية سائلة أو التي تزرع على قنطرة من ورق الفلتر، وقد يرجع هذا في المقام الأول الي مدي توفر الأكسجين في البيئة المغذية التي تنمو فيها الجذور. عموما فان العوامل المحيطة التي تساعد علي تكون المواد الكربوهيدراتية هي أساسية وهامة حيث أن الكربوهيدرات تعتبر عامل محدد في انتاج الجذور وأن انخفاض مستوي الكربوهيدرات يؤدي الي عدم تكون الجذور على الأفرع النباتية المنزرعة. يعتبر تنشيط تكوين الجذور على الأفرع المنزرعة بيئة مغذية هي الطريقة السائدة والشائعة الاستخدام بين الباحثين في مجال زراعة الأنسجة النباتية، غير أنه حديثا امكن تنشيط تكوين الجذور بعد النقل الى تربة الزراعة، تعتبر هذه الطريقة هامة حيث أنها ذات قيمة اقتصادية كبيرة خاصة على مستوى الإنتاج التجاري. كما انه من المعلوم أن الجذور المتكونة على بيئة مغذية لا تعمل بكفاءة مرتفعة أو لا تؤدي وظيفتها عند النقل الي تربة الزراعة، وهذا يرجع أساسا الي عدم تكون شعيرات جذرية في البيئة المغذية أو الي فقدان الشعيرات الجذرية قليلة العدد المتكونة على الفرع النباتي عند اجراء عملية النقل.. لهذا فانه يفضل أن يتم تنشيط تكوين الجذور على الأفرع النباتية بعد نقلها الي تربة صناعية ويجب هنا الإشارة الي أنه هناك بعض الأنواع النباتية التي تنتج جذورا فقط في بيئة مغذية ويفشل انتاج مثل هذه الجذور في تربة صناعية، ولذا يجب أن يؤخذ في الاعتبار سلوك النوع النباتي المستخدم.

1. 5 مرحلة الأقلمة Acclimatization stage

نظرا لأن النباتات الناتجة من عملية زراعة الأنسجة النباتية تتميز ببعض المواصفات الخاصة، كمثال لهذا طبقة الكيوتيكل التي تغطي الورقة وتحد من فقد المياه من النبات تعتبر غير موجودة في النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة، هذا لأن مثل هذه النباتات لا تحتاج اليها، حيث أنه ليست هناك مخاوف من فقد المياه أثناء نموها في جو ذات رطوبة مرتفعة.. بجانب هذا فانه وجد أن ثغور النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة النباتية لا تعمل بكفاءة عالية، وبذلك يكون هناك مخاطر لموت النباتات عند نقلها الى تربة صناعية في ظروف الصوبة أو الحقل، لهذا فانه يجري عملية الأقلمة وذلك لتهيئة النباتات على النمو في ظروف الصوبة أو الحقل.

هناك العديد من الأنواع المختلفة للتربة الصناعية التي تستخدم عند نقل الأفرع أو النباتات من البيئات المغذية المعقة الى تربة صناعية، مثال التربة الصناعية التي قد تستخدم soil , sand , pumice , vermiculite , perlite , bark , Peat . وقد تستخدم هذه الأنواع منفردة أو تخلط ببعضا من الأسمدة .. يعتبر مادة Peat ذات درجة حامضية مرتفعة ولهذا فأنها قد تثبط نمو الجذور في بعض الأنواع النباتية كما تعتبر مادة Vermiculite قلوية الي حد ما .. من المعلوم أن افضل تربة صناعية لتشجيع نمو الجذور يجب أن تكون متعادلة أو حامضية قليلا، كما يجب أن يكون لها صفات المقدرة العالية على الاحتفاظ بالرطوبة وكذا التهوية المميز قبل النقل فانه يجب أن تغسل النباتات التالية بالماء المقطر للتخلص من بقايا البيئة المغذية وذلك قبل أن تزرع في تربة صناعية، يراعي عند النقل للتربة الصناعية المحافظة على الرطوبة المرتفعة بالجو المحيط بالنباتات ويتم هذا بواسطة وضعها في صندوق بلاستيكي شفاف أو تغطيتها بواسطة أكياس من البلاستيك الشفاف.

من الطرق الأخرى شائعة الاستعمال خاصة في مجال الانتاج التجاري استعمال الرش الصناعي المتكرر الذي يحافظ على نسبة رطوبة مرتفعة بالجر المحيط، ويتم أقلمة النباتات بواسطة التقليل المتدرج في نسبة الرطوبة المحيطة، ويتم هذا اما بواسطة تقليل عدد مرات الرش أو بواسطة فتح الصندوق او الكيس البلاستيكي المحيط بالنباتات لعدة ساعات تزداد تدريجيا حتي يتم في النهاية ازالة الغطاء المحيط ونمو النباتات في الرطوبة النسبية العادية، ومن الطرق الأخرى التي تستعمل رش النباتات المنقولة بمحلول يقلل من معدل النتح في النباتات المنقولة وبالتالي فإن هذا يؤدي الي زيادة مقدرة النباتات على ملائمة الرطوبة النسبية المنخفضة التي ينقل اليها (1979) .wardle et al.

لابد أن يفهم تماما أن معدل التمثيل الضوئي للنباتات النامية في بيئات صناعيه يعتبر ضئيلا مقارنة بالنباتات النامية في الصوب أو في الحقول. ولهذا فانه يجب أن يعلم القارئ أن عملية نقل النباتات من البيئة المغذية ذات الظروف المتحكم فيها الي تربة صناعية في الصوبة أو الحقل في ظروف بيئية غير متحكم فيها، فان هذا يعني التغيير في العمليات الفسيولوجية بالنباتات ولهذا تعتبر هذه المرحلة حاسمة وهامه للحصول علي نباتات كاملة مناسبة للنمو في الصوب أو الحقل.

2- الاختلافات في النباتات الناتجة Variations in regenerants

عالقا في الذهن المفهوم التقليدي للتكاثر الخضري، فمن المتوقع نظريا أن تكون النباتات الناتجة بطريقة الاكثار بواسطة زراعة الأنسجة النباتية متشابهة وراثيا مع النبات الأم .. غير أن هذه ليست دائما القاعدة حيث أن هناك فرصة كبيرة لحدوث اختلافات بين النباتات الناتجة والنبات الأم، وترجع هذه الاختلافات الي أحد او بعض العوامل التالية:

- حدوث طفره في بعض الخلايا وانتاج ما يسمي بالكيميرا.

- التغيير في عدد الكروموسومات.

- تغير الوضع النسبي للكروموسومات بداخل الخلية.

- حدوث طفرات في النواه أو السيتوبلازم الخلوي.

- حدوث بعض التغيرات المورفولوجية التي تشمل تغير شكل الأوراق، التقزم، تغير شكل الازهار.

- ظهور النباتات الالبينو وهي غالبا مشكلة سائدة في محاصيل الحبوب وترجع أساسا الي نقص كفاية البلاستيدات.

- يرجع وجود هذه الاختلافات في النباتات الناتجة الى تأثير أحد أو بعض مكونات البيئة المغذية الصناعية التي ينمو عليها النسيج النباتي .. ولقد أثبت العالم (1979) Jones أن منظم النمو السيتوكينين الذي يضاف الى البيئة المغذية بهدف تنشيط نمو الأفرع النباتية، قد يسبب هو نفسه تقزم للنباتات الناتجة، تنبيط نمو الجذور، زيادة التفرع .. هناك أيضا بعض الاختلافات التي يسببها وجود الاكسين في البيئة المغذية وهذه تشمل ضعف الخصوبة، تشوه شكل بتلات الأزهار والأوراق، ضعف النمو، يجب الإشارة هنا الي ان هذه الاختلافات تظهر عند استخدام التركيزات الغير مناسبة من الاكسين . هناك بعض العناصر الأخرى التي تساهم في انتاج نباتات مغايره للنبات الام وهذه تشمل اختلافات الضغط الاسموزي، تركيز مادة الآجار في البيئة المغذية، الحرارة، وجود الجبرالينات.

بالرغم من أن حدوث اختلافات في النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة النباتية أمر غير مرغوب فيه، خاصة عندما يراد اكثار المادة النباتية، غير أن هناك بعض المزايا التي قد يستفاد بها مربي النباتات، لأن هذه الاختلافات توفر له فرصة كبيرة للبحث عن الصفات المرغوب فيها.