لتقدير التركيب البنائي الأولى للإنزيمات يجب أن يتم نزع المجاميع الرابطة أولا ثم أكسدة أواصر ثنائية الكبريتيد للحصول على سلاسل ببتيدية مستقيمة ثم تحطيم الأواصر الببتيدية الذي تربط الأحماض الأمينية مع بعضها بواسطة التحلل المائي فالأواصر الببتيدية ثابتة في أس هيدروجيني متعادل ويتم تحليل الإنزيمات أما بواسطة الحامض أو القاعدة ولا يفصل التحلل الإنزيمي وتتضمن الخطوة الأولى في تعين التركيب البنائي الأولى تعين تركيب البروتين وتحديد عدد أنواع السلاسل الببتيدية المختلفة في الإنزيمات وتحديد نهاية كل سلسلة ببتيدية وإيجاد عدد النهايات الحاوية على مجاميع طرقية أمينيه أو كربوكسيلية ومن المحتمل وجود نفس الحامض الأميني الطرفي في حالة الإنزيمات متعددة السلسلة وفي بعض الأحيان يكون الحامض الأميني الطرفي موجود داخل جريئة الإنزيم مما يصعب للمادة الكيماوية المستعملة من تعين النهايات الطرفية من الوصول إلية ويمكن التعرف على المجموعة الأمينية من نوع ألفا الموجودة في الحامض الأميني الطرفي الواقع في السلسلة الببتيدية باستعمال كاشف سأنجر Sanger ، ففي طريقة سانجر تتفاعل المجموعة الأمينية من نوع ألفا الموجودة في الحامض الأميني الطرفي الواقع في السلسلة الببتيدية مع الكاشف fluoro-2,4-dinitrobenzene) DNP-1) لتكوين مركب مشتق مع السلسلة الببتيدية يعرف  dinitrophenyl amino acid-N-2,4 وعند إضافة محلول 6 عياري من حامض الهيدروكلوريك بدرجة 105م لمدة 24 ساعة تتحلل جميع الأواصر الببتيدية ماعدا الآصرة المتكونة بين DNP ومجموعة الأمين من نوع ألفا الذي تقاوم التحلل الحامضي مما يحتوي ناتج التحلل على الأحماض الأمينية الحرة المكونة أصلا للسلسلة الببتيدية ماعدا الحامض الأميني الطرفي والذي يحتوي على المجموعة الأمينية الطرفية مما تكون على شكل مشتق من DNP الذي يمكن فصلة عن بقية الأحماض الأمينية الحرة بواسطة الفصل الكرومات وكرافي ومقارنته مع محلول قياسي لمشتقات DNP للأحماض الأمينية المختلفة والتعرف على الحامض الأميني الطرفي وتتفاعل المجاميع الأمينية عدا المجموعة الأمينية ألفا الموجودة في الحامض الأميني الطرفي مع كاشف سأنجر إلا انه يمكن التفريق بواسطة الكرومات وكرافي بين نواتج هذا للتفاعل وبين N-DNP amino acids ويمكن الكشف عن كميات قليلة جدا من المركب الناتج من تفاعل الأحماض الأمينية و dansyl chloride كما يمكن أيضا التعرف على الحامض الأميني الطرفي الحاوي على مجموعة كربوكسيل حرة عند معاملة الإنزيم مع sodium borohydride الذي يهاجم المجموعة الكربوكسيلية الحرة ولأجل القيام بهذا التفاعل لابد من أسترة المجاميع الكربوكسيلية مما يحول ذلك المجاميع الكربوكسيلية إلى تحولات أمينيه من نوع ألفا أما المجاميع الكربوكسيلية الأخرى الموجودة في حامض الأسبارتيك والكلوتاميك ستختزل مما ينتج كحولات أمينيه ولكنها ليست من النوع ألفا، يمكن التفريق بينهما بواسطة الطرق الكرومات وكرافية المختلفة ومن ما ذكر أعلاه يمكن التعرف على الأحماض الأمينية الطرفية الحاوية على المجاميع الأمينية والكربوكسيلية ثم التعرف على السلاسل الببتيدية المختلفة الموجودة في جزيئة الإنزيم ويمكن تحطيم الأواصر الموجودة بين السلاسل الببتيدية بعدة طرق بينما تحطيم الأواصر الثنائية الكبريتيد باستعمال حامض البيرفورميك حيث تتأكسد كل جزيئة سستين إلى جزيئتين حامض السستائيك دون التأثير على الأواصر الببتيدية حيث يعمل حامض البيروفيك على أكسدة كل من Met, Try ولمنع حدوث ذلك يستخدم بيتا - ميركابتو ايثانول لتفكيك الأواصر ثنائية الكبريتيد بالاختزال ومن ثم إضافة الكيل إلى مجاميع السلفا هيدريل لمنع إعادة تكوين -S-S- ويمكن تحطيم الأواصر الايونية من خلال تعريض الوسط إلى أس هيدروجيني مناسب على تراكيز ملحية عالية أو باستعمال اليوريا أو هيدروكلوريد الكواندين ثم فصل السلاسل عن بعضها البعض الآخر بواسطة الكروماتوكرافيا أو الهجرة في مجال كهربائي مما يسهل ذلك من الحصول على سلاسل ببتيدية نقية ويحتوي العديد من الإنزيمات على عدد من السلاسل الببتيدية المتشابه يتصل بعضها مع البعض الآخر بواسطة أواصر لا تساهمية ويمكن التأكد منها من خلال وجود مجموعة أمينيه من نوع ألفا ومجموعة كربوكسيلية من نوع ألفا واحده فقط أو عدم إمكانية فصل أي من السلاسل الببتيدية عن بعضها البعض الآخر بعد تحطيم الأواصر غير التساهمية الذي تربط تلك السلاسل فيما بينها ويلاحظ انخفاض الوزن الجزيئي للإنزيم عند تحطيم الأواصر إلى النصف ويمكن تقدير الوزن الجزيئي للسلاسل الببتيدية باستعمال الترشيح بالهلام gel filtration والطرد المركزي عالي السرعة وبعد ذلك القيام بتحليل السلسلة الببتيدية المتعددة بصورة كاملة إلى مكوناتها من الأحماض الأمينية ثم تقدير تركيز كل حامض أميني على حدة ويستعمل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني للتقدير الكمي للأحماض الأمينية حيث يتم وضع النموذج على عمود فصل يحتوي مبادل ايوني موجب الشحنة ثم يوضع خلال عمود الفصل محلول منظم بحيث تزداد قيمة الأس الهيدروجيني وتركيز الأملاح فيه تدريجيا حيث تغادر الأحماض الأمينية ذات السلاسل الطرفية الحامضية أو القطبية قبل الأحماض الأمينية ذات السلاسل القاعدية أو اللاقطبية والسبب هو الألفة النسبية الموجودة بين الشحنات الموجودة على المبادل الأيوني وتلك على الأحماض الأمينية وتختار الظروف الذي تسمح بمغادرة كل حامض أميني بصورة منفصلة عن الآخر على الحمود ويخلط ننها يدرين مع المحلول الغاسل لأن الننها يدرين يتفاعل مع معظم الأحماض الامينية ليعطي لون ازرق - ارجواني الذي يتم امتصاصه على طول موجي 570 نانوميتر بينما يعطي البرولين لونا اصفر يمتص اللون على طول موجي 440 نانوميتر ويمكن مراقبة الألوان الناتجة بشكل مستمر على أطوال موجية قدرها 570 و 440 نانوميتر فأنه بالإمكان تقدير تركيز كل حامض أميني، يجب أن يؤخذ بنظر الاعتبار طريقة التحليل المستعملة مثل استخدام تحلل حامضي باستخدام 6 ع حامض الهيدروكلوريك على درجة 105م لمدة 24 ساعة يسبب تحلل السلسلة الببتيدية إلى أحماض أمينية ويسبب فقد بعض التربتوفان كما يتحلل الكلوتامين والاسبارجين إلى أحماضهما وأن قياس كمية الامونيا الناتجة يعطي دلالة على الكمية الكلية للامايدات الموجودة في بروتين الإنزيم أما في حالة استعمال تحلل قاعدي سيؤدي إلى تحلل الامايدات عندما يستخدم كع هيدروكسيد الصوديوم ثم تحطيم الببتيدات المتعددة ولكن يتم الحصول على تربتوفان بدون فقد لكن يحصل فقد في الأحماض الأمينية التالية السستين، السستائين، السيرين والثريونين، لذلك يجب في حالة استعمال تحلل حامضي أو قاعدي يقدر التركيز الكلي للأحماض الأمينية الموجودة ومن خلال النتائج المستحصل عليها في تقدير الوزن الجزيئي يمكن تقدير عدد جزيئات كل حامض أميني موجود في الببتيد المتعدد ويمكن التعرف على تعاقب أو تسلسل الأحماض الأمينية في السلسلة الببتيدية بطريقة أيدامان Edman إلا أن التعرف على الحامض الأميني الطرفي الحاوي على المجموعة الأرمينية الطرفية ثم التعرف عليها باستعمال طريقة سأنجر ويستخدم في طريقة أيدامان كاشف phenyl isothiocyanate الذي يتفاعل تحت الظروف القاعدية مع المجموعة الامينية من نوع ألفا الذي تعود للحامض الأميني الطرفي في السلسلة الببتيدية ومن محاسن هذه الطريقة انه عند تحويل ظرف التفاعل القاعدي إلى الجانب الحامضي قليلا فأن المركب المتكون عند تفاعل الحامض الأميني مع الكاشف سينفصل عن السلسلة الببتيدية المتعددة دون تحطيم أو تكسير بقية الأواصر الببتيدية الأخرى وبذلك يمكن التعرف على PTH amino acids ثم الحامض الأميني الطرفي الذي كان موجود أصلا في السلسلة الببتيدية بواسطة كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة أو بواسطة كروماتوكرافيا غاز - سائل بينما بقية السلسلة الببتيدية المتعددة تبقى كما هي متصلة مع بعضها وبالإمكان إعادة التجربة مرة ثانية وثالثة والتعرف على الحامض الأميني الذي يليه ويمكن التعرف على الحامض الأميني الطرفي الحاوي على المجموعة الكربوكسيلية باستخدام العوامل المختزلة أو استخدام طريقة إنزيمية باستخدام carboxypeptidase الذي يفكك الأواصر الببتيدية بصورة متعاقبة بدأ من مجموعة الكربوكسيل الطرفية، نظريا يمكن البدء من أي طرفي السلسلة الببتيدية سواء كانت الحاوية على المجموعة الأمينية أو الكربوكسيلية للتعرف على تعاقب الأحماض الأمينية في السلسلة الببتيدية المتعددة أما من الناحية العملية فأن ذلك صعبا بسبب تعقيد التركيب البنائي الأولى للسلاسل الببتيدية الطويلة حيث من الضروري تكسير السلاسل الببتيدية إلى وحدات صغيرة يسهل التعامل معها باستعمال مركبات كيماوية مثل بروميد السيانوجين أو الإنزيمات المحللة للبروتينات، فأن المركبات الكيمياوية أو الإنزيمات ستؤدي إلى تجزئة الببتيدات ثم فصلها عن بعضها البعض الآخر بواسطة كروماتوكرافيا أو الهجرة في مجال كهربائي وبالنظر لصغر تلك الأجزاء فأنه من السهل معرفة تعاقب الأحماض الأمينية بالطرق السابقة بعد تعين التركيب البنائي الأولى الكامل للسلسلة الببتيدية يتم ترقيم الأحماض الأمينية ويبدأ الترقيم من الطرف الحاوي على المجموعة الأمينية، أن الطرق السابقة لا تستطيع تعين موقع الجسور الكبريتيدية الثنائية ولذلك يجب استعمال نموذج جديد من الإنزيم ثم أجراء تحلل جزئي عن طريق تكسير بعض الأواصر الببتيدية دون إلحاق الضرر في الروابط أو الأواصر ثنائية الكبريتيد لذلك يستخدم 5ع من حامض الهيدروكلوريك أو استعمال إنزيم الببسين على أس هيدروجيني 2 ويعمل الببسين على تكسير الأواصر الببتيدية الموجودة بين العديد من الأحماض الأمينية وخاصة الأواصر الموجودة بين حامضين أرمينيين لا قطبيين أو غير محبين للماء ثم فصل الأجزاء الببتيدية الناتجة عن بعضها البعض الآخر ثم معاملة الأجزاء المعزولة بواسطة حامض البيرفورميك مما يسهل ذلك تكسير الأجزاء الحاوية على أواصر كبريتيدية إلى أجزاء اصغر كنتيجة لتأكسد S-S ثم التعرف على تعاقب الأحماض الأمينية حول كل آصرة كبريتيدية ثنائية بالرجوع إلى التركيب البنائي الأولي لجزئية بروتين الإنزيم مما يصبح من الممكن تعين مواقع هذه الأواصر في جزيئة الإنزيم الكامل.

مواضيع ذات صلة

طرق دراسة حركية التفاعلات الإنزيمية- دراسة السرعة الأولية

تركيز المادة الأساس

العوامل المؤثرة على سرعة التفاعلات الكيمياوية

القوة الحرارية للتفاعلات الإنزيمية

التوازن الكيمياوي Chemical Equilibrium

تقسيم التفاعلات الانزيمية

تقانات التفاعل السريع

طرق دراسة حركية التفاعلات الإنزيية - دراسة السرعة الأولية

الآلية التحفيزية للرايبونيو كليز

الآلية التحفيزية للتربسين

الآلية التحفيزية للكيموتربسين

الآلية التحفيزية لأنزيم Serine proteases